| 中文摘要 | 第11-12页 |
| 英文摘要 | 第12页 |
| 第一部分 文献综述 | 第13-23页 |
| 1 PCV生物学特征及PMWS流行 | 第14-17页 |
| 1.1 猪圆环病毒分类与形态 | 第14-15页 |
| 1.2 理化学特性 | 第15页 |
| 1.3 PCV的细胞培养特征 | 第15-16页 |
| 1.4 PMWS的流行病学 | 第16-17页 |
| 2 猪圆环病毒的分子生物学特征 | 第17-21页 |
| 2.1 病毒的基因组 | 第17-18页 |
| 2.2 病毒的复制与转录 | 第18-19页 |
| 2.3 病毒的结构蛋白 | 第19-21页 |
| 3 PCV-2的致病机理 | 第21-22页 |
| 4 PCV-2的研究展望 | 第22-23页 |
| 第二部分 研究内容 | 第23-55页 |
| 第一章 PCV-2 ORF3、ORF4、ORF5基因克隆及在大肠杆菌中的表达 | 第23-46页 |
| 1 材料 | 第23页 |
| 1.1 病毒 | 第23页 |
| 1.2 细胞 | 第23页 |
| 1.3 载体 | 第23页 |
| 1.4 菌种 | 第23页 |
| 1.5 常用化学试剂及主要仪器 | 第23页 |
| 1.6 常用缓冲液 | 第23页 |
| 1.7 抗生素 | 第23页 |
| 1.8 抗体 | 第23页 |
| 2 方法 | 第23-32页 |
| 2.1 PCV-2(HZ0201)病毒DNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.2 引物设计 | 第24-25页 |
| 2.3 PCR扩增 | 第25-26页 |
| 2.3.1 PCV-2／HZ0201株ORF3的PCR扩增 | 第25-26页 |
| 2.3.2 PCV-2／HZ0201株ORF4的PCR扩增 | 第26页 |
| 2.3.3 PCV-2／HZ0201、98-15237毒株ORF5的PCR扩增 | 第26页 |
| 2.4 PCR产物的克隆 | 第26-29页 |
| 2.4.1 PCR产物的纯化 | 第26-27页 |
| 2.4.2 连接 | 第27页 |
| 2.4.3 感受态细胞的制备 | 第27页 |
| 2.4.4 转化 | 第27-28页 |
| 2.4.5 筛选、鉴定 | 第28页 |
| 2.4.6 重组质粒载体的小量制备 | 第28页 |
| 2.4.7 重组质粒的双酶切鉴定 | 第28页 |
| 2.4.8 重组质粒的PCR鉴定 | 第28-29页 |
| 2.4.9 序列的测定及分析 | 第29页 |
| 2.5 PCV-2 ORF3基因在大肠杆菌中的表达 | 第29-32页 |
| 2.5.1 重组表达菌的诱导 | 第29页 |
| 2.5.2 重组蛋白的大量表达 | 第29页 |
| 2.5.3 SDS-PAGE分析 | 第29-30页 |
| 2.5.4 Western blot印迹法鉴定 | 第30页 |
| 2.5.5 重组蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| 2.5.5.1 包涵体的分离 | 第30-31页 |
| 2.5.5.2 包涵体的复性 | 第31页 |
| 2.5.6 蛋白的纯化 | 第31页 |
| 2.5.6.1 透析袋的处理 | 第31页 |
| 2.5.6.2 蛋白的纯化 | 第31页 |
| 2.5.7 蛋白浓度的测定 | 第31-32页 |
| 3 结果 | 第32-46页 |
| 3.1 基因的PCR扩增 | 第32-35页 |
| 3.1.1 PCV-2 ORF3的PCR扩增 | 第32页 |
| 3.1.2 PCV-2 ORF4的PCR扩增 | 第32-34页 |
| 3.1.3 PCV-2 ORF5的PCR扩增 | 第34-35页 |
| 3.2 重组质粒的PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 3.2.1 PCV-2 ORF3重组质粒的PCR鉴定 | 第35页 |
| 3.2.2 PCV-2 ORF4重组质粒的PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 3.2.3 PCV-2 ORF5重组质粒的PCR鉴定 | 第36页 |
| 3.3 重组质粒的双酶切鉴定 | 第36-38页 |
| 3.3.1 PCV-2 ORF3重组质粒的双酶切鉴定 | 第36-37页 |
| 3.3.2 PCV-2 ORF4重组质粒的双酶切鉴定 | 第37页 |
| 3.3.3 PCV-2 ORF5重组质粒的双酶切鉴定 | 第37-38页 |
| 3.4 基因序列的测定 | 第38-40页 |
| 3.4.1 重组PCV-2 ORF3基因序列测定 | 第38-39页 |
| 3.4.2 重组PCV-2 ORF4基因序列测定 | 第39页 |
| 3.4.3 重组PCV-2 ORF5基因序列测定 | 第39-40页 |
| 3.5 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第40-41页 |
| 3.5.1 PCV-2 ORF3重组表达产物的SDS-PAGE分析 | 第40-41页 |
| 3.5.2 PCV-2 ORF4重组表达产物的SDS-PAGE分析 | 第41页 |
| 3.5.3 PCV-2 ORF5重组表达产物的SDS-PAGE分析 | 第41页 |
| 3.6 Western blot分析 | 第41-43页 |
| 3.6.1 PCV-2 ORF3重组表达蛋白的Western blot分析 | 第41-43页 |
| 3.6.2 PCV-2 ORF4重组表达蛋白的Western blot分析 | 第43页 |
| 3.6.3 PCV-2 ORF5重组表达蛋白的Western blot分析 | 第43页 |
| 3.7 蛋白的纯化 | 第43-46页 |
| 3.7.1 PCV-2 ORF3蛋白的纯化 | 第43-45页 |
| 3.7.2 PCV-2 ORF4蛋白的纯化 | 第45-46页 |
| 第二章 PCV-2 ORF3、ORF4、ORF5在PK15细胞中的表达 | 第46-53页 |
| 1 材料 | 第46页 |
| 1.1 病毒 | 第46页 |
| 1.2 细胞 | 第46页 |
| 1.3 载体 | 第46页 |
| 1.4 菌种、质粒 | 第46页 |
| 1.5 常用化学试剂及主要仪器 | 第46页 |
| 1.6 常用缓冲液 | 第46页 |
| 1.7 抗生素 | 第46页 |
| 1.8 脂质体 | 第46页 |
| 2 方法 | 第46-48页 |
| 2.1 PCV-2(HZ0201)病毒DNA的提取 | 第46页 |
| 2.2 引物设计 | 第46页 |
| 2.3 PCV-2(HZ0201)ORF3、ORF4、ORF5基因的PCR扩增 | 第46页 |
| 2.4 真核表达载体构建 | 第46-48页 |
| 2.4.1 PCR产物纯化 | 第46页 |
| 2.4.2 连接 | 第46-47页 |
| 2.4.3 感受态细胞制备 | 第47页 |
| 2.4.4 转化 | 第47页 |
| 2.4.5 筛选、鉴定 | 第47页 |
| 2.4.6 序列测定及分析 | 第47页 |
| 2.4.7 重组质粒的抽提与纯化 | 第47-48页 |
| 2.5 细胞培养 | 第48页 |
| 2.6 细胞转染 | 第48页 |
| 2.7 转染细胞的观察 | 第48页 |
| 3 结果 | 第48-53页 |
| 3.1 真核表达载体的构建 | 第48-51页 |
| 3.1.1 PCV-2 ORF3、ORF4、ORF5基因的PCR扩增 | 第48-49页 |
| 3.1.2 重组质粒的PCR鉴定 | 第49-50页 |
| 3.1.3 重组质粒双酶切鉴定 | 第50-51页 |
| 3.1.4 测序分析 | 第51页 |
| 3.2 细胞转染后荧光的观察 | 第51-53页 |
| 第三章 讨论 | 第53-55页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 附录A | 第58-59页 |
| 附录B | 第59-63页 |
| 附录C | 第63-64页 |
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