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嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶BGL3基因的克隆、表达和分子改造

论文目录

英文缩略词	第4-10页
中文摘要	第10-11页
Abstract	第11-12页
1 引言	第13-22页
1.1 纤维素及纤维素酶概况	第13-14页
1.2 嗜热真菌研究概况	第14页
1.3 β-葡萄糖苷酶	第14-19页
1.3.1 β-葡萄糖苷酶的概况	第14-15页
1.3.2 β-葡萄糖苷酶的理化性质	第15页
1.3.3 β-葡萄糖苷酶的结构和功能研究	第15-16页
1.3.4 β-葡萄糖苷酶的催化机制	第16-18页
1.3.5 β-葡萄糖苷酶的应用	第18-19页
1.3.5.1 β-葡萄糖苷酶在大豆异黄酮水解中的应用	第18页
1.3.5.2 β-葡萄糖苷酶在清洁燃料生产上的应用	第18-19页
1.4 β-葡萄糖苷酶的分子改造	第19-20页
1.5 研究内容及意义	第20-22页
1.5.1 技术路线	第20页
1.5.2 研究内容	第20-21页
1.5.3 研究意义	第21-22页
2 材料与方法	第22-39页
2.1 实验材料	第22-23页
2.1.1 菌株和质粒	第22页
2.1.2 生物信息学分析网站和软件	第22页
2.1.3 酶与生化试剂	第22页
2.1.4 培养基及溶液配制	第22-23页
2.2 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶基因bgl3的克隆	第23-26页
2.2.1 嗜热毛壳菌RNA的提取	第23-24页
2.2.2 cDNA的合成	第24页
2.2.3 PCR扩增bgl3基因	第24-26页
2.2.3.1 引物设计	第24-25页
2.2.3.2 PCR扩增体系	第25页
2.2.3.3 PCR扩增条件	第25页
2.2.3.4 目的条带胶条回收	第25-26页
2.3 β-葡萄糖苷酶 BGL3 酵母工程菌的获得	第26-30页
2.3.1 线性化pPIC9K载体的制备	第26页
2.3.1.1 酶切反应体系	第26页
2.3.1.2 线性化程度检测	第26页
2.3.2 目的基因片段和pPIC9K线性化载体的连接	第26-27页
2.3.2.1 必克隆反应体系	第26-27页
2.3.3 大肠杆菌的转化	第27页
2.3.3.1 阳性重组转化子的鉴定	第27页
2.3.4 重组质粒pPIC9K-bgl3的线性化和去磷酸化	第27-28页
2.3.4.1 重组质粒pPIC9K-bgl3酶切反应体系	第27-28页
2.3.4.2 重组质粒pPIC9K-bgl3线性化回收	第28页
2.3.5 重组质粒pPIC9K-bgl3转化毕赤酵母GS115感受态细胞	第28-29页
2.3.5.1 制备毕赤酵母GS115感受态细胞	第28页
2.3.5.2 重组质粒pPIC9K-bgl3电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞	第28-29页
2.3.6 重组质粒pPIC9K-bgl3酵母工程菌的筛选	第29页
2.3.7 重组质粒pPIC9K-bgl3酵母工程菌的验证	第29-30页
2.3.7.1 PCR反应体系	第29页
2.3.7.2 PCR反应条件	第29-30页
2.4 pPIC9K-bgl3酵母工程菌的诱导表达和分离纯化	第30-31页
2.4.1 pPIC9K-bgl3酵母工程菌的诱导表达	第30页
2.4.2 表达产物的分离和纯化	第30-31页
2.4.2.1 纯化产物浓度的测定	第30-31页
2.4.2.2 纯化产物的SDS-PAGE分析	第31页
2.5 β-葡萄糖苷酶BGL3的分子改造	第31-37页
2.5.1 β-葡萄糖苷酶BGL3非保守氨基酸的定点突变	第31-34页
2.5.1.1 β-葡萄糖苷酶BGL3非保守氨基酸突变位点的获取	第31-33页
2.5.1.2 PCR产物的消化	第33页
2.5.1.3 消化产物转化大肠杆菌	第33-34页
2.5.1.4 阳性转化子的PCR鉴定	第34页
2.5.1.5 突变体酵母工程菌的获得	第34页
2.5.1.6 突变体酵母工程菌诱导蛋白的分离和纯化	第34页
2.5.2 β-葡萄糖苷酶BGL3底物结合氨基酸的丙氨酸筛选和分析	第34-37页
2.5.2.1 β-葡萄糖苷酶BGL3底物结合氨基酸突变位点的获取	第34-36页
2.5.2.2 PCR产物的消化和转化大肠杆菌	第36页
2.5.2.3 阳性转化子的PCR鉴定	第36页
2.5.2.4 突变质粒的基因测序结果	第36-37页
2.5.2.5 突变体酵母工程菌的获得	第37页
2.6 野生型β-葡萄糖苷酶BGL3和其突变酶的酶学性质研究	第37-38页
2.6.1 野生酶BGL3和突变酶的比活力测定	第37页
2.6.1.1 DNS法测定野生酶BGL3和突变酶的酶活力	第37页
2.6.1.2 DNS-葡萄糖标准曲线的配制	第37页
2.6.1.3 野生酶BGL3和突变酶的比活力测定方法	第37页
2.6.2 野生酶BGL3和突变酶的反应的最适pH测定	第37-38页
2.6.3 野生酶BGL3和突变酶反应的最适温度测定	第38页
2.6.4 野生酶BGL3和突变酶的热稳定性测定	第38页
2.6.5 野生酶BGL3和突变酶的动力学参数测定	第38页
2.7 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶BGL3及其突变酶的三维建模	第38-39页
3 结果与分析	第39-56页
3.1 嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶基因bgl3的真核表达与分析	第39-45页
3.1.1 β-葡萄糖苷酶基因bgl3片段的克隆和序列分析	第39-41页
3.1.1.1 嗜热毛壳菌总RNA的提取和基因bgl3的克隆	第39-40页
3.1.1.2 基因bgl3序列的测定和分析	第40-41页
3.1.2 β-葡萄糖苷酶BGL3酵母工程菌的获得	第41-42页
3.1.2.1 重组质粒pPIC9K-bgl3的线性化、去磷酸化以及电击转入酵母细胞	第41页
3.1.2.2 阳性酵母工程菌的鉴定	第41-42页
3.1.3 pPIC9K-bgl3酵母工程菌的诱导表达和分离纯化	第42-43页
3.1.3.1 pPIC9K-bgl3酵母工程菌的诱导表达及纯化	第42-43页
3.1.4 β-葡萄糖苷酶BGL3的酶学性质研究	第43-45页
3.1.4.1 β-葡萄糖苷酶BGL3的比活力测定	第43-44页
3.1.4.2 β-葡萄糖苷酶BGL3反应的最适pH值测定	第44页
3.1.4.3 β-葡萄糖苷酶BGL3的反应的最适温度测定	第44页
3.1.4.4 β-葡萄糖苷酶BGL3的热稳定性测定	第44-45页
3.1.4.5 β-葡萄糖苷酶BGL3的动力学参数测定	第45页
3.2 β-葡萄糖苷酶非保守氨基酸突变基因的真核表达及分析	第45-50页
3.2.1 β-葡萄糖苷酶非保守氨基酸突变基因的获取	第45-46页
3.2.2 突变体酵母工程菌的获得	第46-47页
3.2.2.1 突变体酵母工程菌的PCR鉴定	第46-47页
3.2.3 突变体蛋白的表达和纯化及SDS-PAGE分析	第47页
3.2.4 突变酶的酶学性质测定	第47-50页
3.2.4.1 突变酶的比活力测定	第47页
3.2.4.2 突变酶反应的最适pH测定	第47-48页
3.2.4.3 突变酶反应的最适温度测定	第48-49页
3.2.4.5 突变酶动力学参数的测定	第49-50页
3.3 β-葡萄糖苷酶底物结合位点突变基因的真核表达及分析	第50-56页
3.3.1 β-葡萄糖苷酶底物结合氨基酸突变位点的获取	第50页
3.3.1.1 突变质粒的基因验证	第50页
3.3.2 突变体酵母工程菌的获得	第50-51页
3.3.3 突变体蛋白的表达和纯化及SDS-PAGE分析	第51页
3.3.4 突变酶的酶学性质测定	第51-54页
3.3.4.1 突变酶的比活力测定	第51-52页
3.3.4.2 突变酶反应的最适pH测定	第52页
3.3.4.3 突变酶的反应的最适温度测定	第52-53页
3.3.4.4 突变酶的热稳定性测定	第53页
3.3.4.5 突变酶的动力学参数的测定	第53-54页
3.3.5 BGL3和底物结合氨基酸位点突变酶的三维结构比较	第54-56页
4 讨论	第56-58页
4.1 β-葡萄糖苷酶的定点突变	第56页
4.2 β-葡萄糖苷酶的酶活性质测定	第56-57页
4.3 β-葡萄糖苷酶底物结合关键氨基酸位点的筛选	第57-58页
5 结论	第58-59页
参考文献	第59-66页
致谢	第66页

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