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当前位置:教育论文中心首页--博士论文--两种葡萄卷叶伴随病毒的基因克隆、原核表达及葡萄遗传转化体系的初步建立
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两种葡萄卷叶伴随病毒的基因克隆、原核表达及葡萄遗传转化体系的初步建立
 
     论文目录
 
摘要第1-10页
Abstract第10-13页
缩略词表第13-15页
第一章 文献综述第15-37页
   ·研究的目的与意义第15-17页
   ·葡萄卷叶病研究进展第17-27页
     ·葡萄卷叶病的发生、分布及危害第17-18页
     ·葡萄卷叶病的病原及病毒的寄主范围第18页
     ·GLRaVs传播途径第18-19页
     ·GLRaVs的检测方法第19-20页
     ·GLD防治措施第20-21页
     ·GLRaVs的分子生物学第21-25页
       ·GLRaVs的分类及基本特性第21页
       ·GLRaVs的基因组结构特征及主要表达产物的功能第21-23页
       ·Closteroviridae成员基因表达策略第23-25页
     ·GLRaV-2研究进展第25-26页
     ·GLRaV-3研究进展第26-27页
   ·葡萄遗传转化研究进展第27-32页
     ·葡萄遗传转化途径第27-28页
     ·葡萄再生系统的建立第28-31页
       ·叶片、叶柄、茎段再生培养第29-30页
       ·花药再生培养第30-31页
     ·影响葡萄遗传转化的因素第31-32页
   ·植物病毒RdRp基因介导的抗病性研究进展第32-37页
     ·由RdRp基因介导的抗病性第33-35页
       ·全长RdRp基因介导的抗病性第33页
       ·由RdRp亚基介导的抗病性第33-34页
       ·由缺失或突变的RdRp基因介导的抗病性第34-35页
     ·RdRp基因介导的抗病机制第35-36页
     ·展望第36-37页
第二章 GLRaV-2 RdRp基因及GLRaV-3 RdRp和CP基因克隆与序列分析第37-62页
   ·前言第37页
   ·材料和方法第37-44页
     ·植物材料及主要试剂第37-38页
     ·双抗体夹心ELISA(Double Antibody Sandwich ELISA,DAS-ELISA)第38页
     ·dsRNA提取第38-39页
     ·RT-PCR检测第39页
     ·引物设计与合成第39页
     ·基因克隆与序列测定第39-44页
       ·反转录合成第一链cDNA第39-40页
       ·PCR扩增第40-41页
       ·重叠延伸PCR扩增GLRaV-3全长RdRp基因第41页
       ·PCR产物的纯化与回收第41页
       ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第41-43页
       ·质粒DNA的小量制备第43页
       ·质粒DNA的去磷酸化第43-44页
       ·PCR产物的克隆与测序第44页
     ·序列分析第44页
   ·结果与分析第44-60页
     ·GLRaVs的检测结果第44-46页
       ·收集材料的症状表现第44-45页
       ·DAS-ELISA检测结果第45-46页
       ·dsRNA提取及RT-PCR第46页
     ·GLRaV-3 RdRp基因的克隆与序列分析第46-52页
       ·GLRaV-3 RdRp基因的RT-PCR和重叠延伸第46-48页
       ·GLRaV-3 RdRp基因序列分析第48-52页
     ·GLRaV-3 CP基因的克隆与序列分析第52-55页
       ·GLRaV-3 CP基因的克隆第52页
       ·GLRaV-3 CP基因序列分析第52-55页
     ·GLRaV-2 RdRp基因的克隆与序列分析第55-60页
       ·GLRaV-2 RdRp基因克隆第55-56页
       ·GLRaV-2 RdRp基因序列分析第56-60页
   ·小结与讨论第60-62页
第三章 原核表达及相应抗血清的制备第62-82页
   ·前言第62页
   ·材料与方法第62-68页
     ·质粒、菌株及主要试剂第62-63页
     ·原核表达载体的构建第63-64页
       ·GLRaV-2 RdRp基因原核表达载体的构建第63-64页
       ·GLRaV-3 RdRp基因原核表达载体的构建第64页
       ·GLRaV-3 CP基因原核表达载体的构建第64页
     ·原核表达及SDS-PAGE分析第64-65页
       ·原核表达第64页
       ·SDS-PAGE电泳第64-65页
     ·GLRaV-2 CP蛋白原核表达体系的改进第65页
     ·重组蛋白的大量制备、纯化及定量第65-66页
     ·抗血清的制备第66页
       ·免疫家兔第66页
       ·抗血清的收集和保存第66页
     ·间接ELISA(Indirect ELISA,ID-ELISA)测定抗血清的效价第66-67页
     ·Western blotting分析第67页
     ·制备的抗血清用于葡萄样品中的病毒检测第67-68页
       ·A蛋白ELISA(Protein A sandwich ELISA,PAS-ELISA)检测第67-68页
       ·斑点ELISA(Dot-blot immunobinding assay,Dot-ELISA)检测第68页
   ·结果与分析第68-80页
     ·原核表达载体构建第68-70页
       ·GLRaV-2 RdRp基因原核表达载体构建第68-69页
       ·GLRaV-3 RdRp基因原核表达载体构建第69-70页
       ·GLRaV-3 CP基因原核表达载体构建第70页
     ·原核表达及抗原性分析第70-73页
       ·GLRaV-2 RdRp基因在E.coli中的诱导表达第70-71页
       ·GLRaV-3 RdRp基因在E.coli中的表达第71页
       ·GLRaV-3 CP基因在E.coli中的表达及抗原性分析第71-73页
       ·用改进后的原核表达体系对GLRaV-2 CP基因进行原核表达第73页
     ·重组蛋白的浓度测定第73-75页
     ·ID-ELISA测定抗血清的效价第75-76页
     ·制备的抗血清的特异性测定第76-78页
     ·PAS-ELISA检测结果第78页
     ·Dot-ELISA检测结果第78-79页
     ·制备的抗血清用不同方法在病毒检测上的效果比较第79-80页
   ·小结与讨论第80-82页
第四章 GLRaV-2 RdRp基因植物表达载体构建及转化烟草研究第82-101页
   ·前言第82页
   ·材料和方法第82-93页
     ·植物材料及主要试剂第82-83页
     ·植物表达载体的构建第83-85页
       ·以表达产生完整RdRp的cDNA植物表达载体的构建第83页
       ·缺失编码GDD保守基元序列的RdRp基因植物表达载体的构建第83-85页
       ·农杆菌感受态细胞的制备及转化第85页
     ·烟草的转化、再生和筛选第85-86页
     ·Km抗性植株的PCR检测第86页
     ·抗性植株的Southern blotting分析第86-90页
       ·植物总DNA的大量提取第87页
       ·Southern杂交及检测步骤第87-90页
     ·转基因植株的Northern Blotting分析第90-93页
       ·植株总RNA提取第90-91页
       ·转基因植株的Northern杂交步骤第91-93页
     ·转基因植株的Western blotting分析第93页
   ·结果与分析第93-99页
     ·可以表达产生完整RdRp的cDNA植物表达载体的构建第93-94页
     ·缺失编码GDD序列的RdRp基因植物表达载体的构建第94-96页
     ·Km抗性烟草的获得第96页
     ·Km抗性烟草的PCR鉴定第96-97页
     ·Km抗性烟草的Southern杂交分析第97-98页
     ·转基因烟草的Northern blotting分析第98-99页
     ·转基因烟草Western blotting分析第99页
   ·小结与讨论第99-100页
   ·展望第100-101页
第五章 葡萄遗传转化体系的建立第101-118页
   ·前言第101页
   ·材料和方法第101-106页
     ·植物材料及主要试剂第101-102页
     ·葡萄再生体系的建立第102-103页
       ·叶片、叶柄和茎段再生培养的培养基配方第102页
       ·叶片、叶柄和茎段愈伤组织诱导和芽再生第102-103页
       ·花药再生培养的培养基配方第103页
       ·花药培养的材料处理方法及培养条件第103页
     ·GLRaV-3 RdRp基因植物表达载体构建第103-104页
     ·GLRaV-3 RdRp基因转化烟草及鉴定第104-105页
       ·转化烟草第104页
       ·Km抗性烟草的分子生物学鉴定第104-105页
     ·根癌农杆菌介导的葡萄遗传转化初步研究第105-106页
       ·Km敏感性实验第105页
       ·转化程序第105页
       ·不同处理方式对葡萄遗传转化效率的影响及葡萄遗传转化第105-106页
       ·Km抗性葡萄的PCR鉴定第106页
   ·结果与分析第106-116页
     ·葡萄再生体系的建立第106-110页
       ·叶片、叶柄和茎段愈伤组织诱导概况第106-107页
       ·不同葡萄外植体以及培养基对愈伤组织诱导效率的影响第107-108页
       ·从愈伤组织中分化出芽的情况第108-110页
       ·花药愈伤组织的诱导及分化第110页
     ·GLRaV-3 RdRp基因植物表达载体的构建第110-111页
     ·GLRaV-3 RdRp基因转化烟草及对Km抗性烟草的鉴定第111-113页
       ·Km抗性烟草的获得第111-112页
       ·Km抗性烟草PCR和PCR-Southern分析第112页
       ·转基因烟草的Northern boltting分析第112-113页
     ·葡萄遗传转化体系的初步建立第113-116页
       ·“红地球”不同外植体对Km的敏感性实验第113-114页
       ·不同因素对葡萄遗传转化效率影响第114页
       ·GLRaV-3 RdRp基因转化葡萄研究第114-116页
       ·Km抗性葡萄的PCR鉴定第116页
   ·小结与讨论第116-118页
     ·葡萄再生体系的优化第116-117页
     ·不同条件对葡萄遗传转化的影响第117-118页
参考文献第118-131页
附录Ⅰ:实验中用植物材料及来源第131-132页
附录Ⅱ:主要试剂及溶液的配制第132-135页
附录Ⅲ:博士在读期间已接受的文章及会议论文第135-136页
致谢第136页

 
 
论文编号BS1232471,这篇论文共136
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