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人参皂甙Rg1对快速老化小鼠肝脏线粒体的保护作用
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【西药科研论文】作者：王月华 贺晓丽 李晓秀 杨海光 毕明刚 杜冠华【摘要】 目的 探讨人参皂苷Rg1防治阿尔茨海默病的作用机制。方法 将8.5月龄快速老化小鼠(SAMP8)随机分为SAMP8对照组、SAMP8给Rg1 10 mg/kg组、SAMP8给Rg1 30 mg/kg组，每组10只。同月龄SAMR1 10只作为对照组。给药65 d后提取肝脏线粒体，测定线粒体呼吸功能、线粒体肿胀度和线粒体膜电位。线粒体于-20℃/20℃反复冻融3次破坏线粒体膜，测定线粒体内MDA含量、SOD活性和LDH含量。结果 与SAMR1相比，SAMP8肝脏线粒体呼吸功能显著降低，表现为线粒体3态呼吸显著降低，4态呼吸改变不明显，呼吸控制指数和磷氧比值显著降低;SAMP8小鼠线粒体膜肿胀度显著增高，线粒体膜电位显著降低。此外，SAMP8线粒体MDA含量显著增多、SOD活性显著升高、LDH显著增高。与SAMP8对照组相比，Rg1 10 和30 mg/kg均可显著改善这些线粒体结构和呼吸功能障碍，改善线粒体内生化功能的改变。结论 人参皂苷Rg1可改善快速老化小鼠线粒体结构和功能障碍。
【关键词】 阿尔茨海默病;快速老化小鼠;线粒体
Protections of Ginsenoside Rg1 on liver mitochondria in senescence accelerated mice
WANG YueHua, HE XiaoLi, LI XiaoXiu， et al.
Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050,China
【Abstract】 Objective To observe the influence of Rg1 on the mitochondria of senescence accelerated mice (SAM) to explore its mechanism on Alzheimer’s disease (AD). Methods The 8?monthold SAM were divided into SAMprone/8 (SAMP8) group, SAMP8 treated with Rg1 10 mg/kg group and 30 mg/kg group. The same old SAMresistance/1 (SAMR1) act as control. After treatment for 65 d, the liver mitochondria was isolated. Mitochondrial respiratory activity, mitochondrial membrane potential and mitochondrial swelling degree were determined. Mitochondrial oxidative stress was determined by measuring the level of lipid peroxidation and the activity of antioxidation enzymes. Results Respiratory control index (RCI), ADP/O ratio, State 3 respiration, and OPR were significantly lower in SAMP8 than those in SAMR1. State 4 respiration was no significantly change in SAMP8 compared with that in SAMR1. At the same time, the loss of mitochondrial membrane potential and the increase of mitochondrial swelling degree were found in SAMP8 liver mitochondria. Additionally, the level of MDA content was increased, the activity of SOD was decreased, and the LDH activity was increased in SAMP8 mitochondria compared with that in SAMR1 mitochondria. Rg1 10 mg/kg and 30 mg/kg significantly improved oxidative phosphorylation process, mitochondrial membrane potential, mitochondria swelling degree, and biochemical functions. Conclusions Rg1 can improve mitochondrial structure and function in SAMP8.
【Key words】 Ginsenoside Rg1;Mitochondria;Senescence accelerated mice
目前，快速老化小鼠(senescence accelerated mice，SAM)作为一个较理想的衰老动物模型已被广泛用于阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)发病机制和寻找抗AD药物的研究〔1〕。SAM包括正常老化的R系(SAMR1)和快速老化的P系(SAMP8)，P系渡过了生长期(4～6月龄)后，迅速出现明显的学习记忆障碍，脑中有明显的AD病变的病理特征〔2〕。研究表明，线粒体形态结构和功能的变化是导致AD能量代谢障碍的重要因素和关键环节，线粒体能量生成的破坏是AD病的发生的潜在诱因〔3～5〕。人参皂苷Rg1是人参根提取物的主要成分之一，其对中枢神经系统的保护作用已成为近年研究的热点。本研究应用快速老化小鼠为动物模型观察人参皂苷Rg1对AD病线粒体损伤的保护作用，探讨人参皂苷Rg1抗AD的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物 8月龄快速老化小鼠由中国医学科学院药用植物研究所毕明刚博士惠赠，体重30～35 g，动物饲养环境保持通风干净，温度22℃～26℃，湿度55%～58%，正常光照，饮水及饲料经高温蒸汽灭菌。饲养半个月后，SAMP8 30只随机分为模型对照组、人参皂苷Rg1低剂量组、人参皂苷Rg1高剂量组，每组10只。同月龄SAMR1小鼠10只作为正常对照组。
1.2 仪器与试剂 人参皂苷Rg1(纯度>98%，HPLC)购于上海融禾医药科技发展有限公司，Rhodamine 123 为SigmaAldrich (St.Louis，MO，USA)产品，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购于南京建成试剂公司，线粒体呼吸仪为英国SI产品(728 Oxygen Meter)。
1.3 给药方法 人参皂苷Rg1低剂量组每天腹腔注射Rg1 10 mg/kg，人参皂苷Rg1高剂量组每天腹腔注射Rg1 30 mg/kg，模型对照组和正常对照组每天腹腔注射生理盐水，共65 d。
1.4 肝脏组织线粒体的制备 小鼠处死后迅速取出肝脏、称重，置于玻璃匀浆器中，加入MSETB缓冲液10 ml/g组织(MSETB缓冲液：210 mmol/L mannitol，70 mmol/L sucrose，0.5 mmol/L EDTA，10 mmol/L TrisHCl，0.2% bovine serum albumin，pH7.4)，手动匀浆10次。所得匀浆液以2 000 r/min离心3 min，取上清12 000 r/min，离心8 min，所得沉淀即为线粒体。以MSETB缓冲液将所得沉淀洗涤一次(12 000 r/min，离心10 min)，按10∶1(v/w)悬于SET缓冲液中(SET缓冲液：280 mmol/L sucrose，0.5 mmol/L EDTA，10 mmol/L TrisHCl，pH7.4)，离心10 min。最后将沉淀悬于SET缓冲液中，整个线粒体制备过程均在4°C进行〔6〕。以Lowry法测定蛋白含量〔7〕，调节稀释比例，使蛋白浓度为5～10 g/L。
1.5 肝脏组织线粒体呼吸检测 采用Clark氧电极测定线粒体呼吸功能〔8，9〕。将新鲜制备的线粒体加入到呼吸反应缓冲液内(150 mmol/L蔗糖，25 mmol/L TrisHCl和10 mmol/L KH2PO4，pH7.4)，使蛋白终浓度为0.5～1.0 mg/ml，维持循环水浴的温度为30℃，加入呼吸底物5 mmol/L谷氨酸和5 mmol/L苹果酸，最后加入0.2 mmol/L ADP启动3态呼吸。计算磷氧比(P/O)、3态呼吸速率(V3)、4态呼吸速率(V4)以及呼吸控制指数(RCI)。P/O=ADP(nmol)/O(nmol)，ADP为每次反应中所加入的ADP量，O为加入ADP后线粒体氧化磷酸化所消耗的氧原子;3，4态呼吸速率(V3，V4)=O(nmol)/Protein(mg)，O为线粒体所消耗的氧原子量，Protein为所加入的线粒体蛋白量;呼吸速率以nmolO·min-1·mg-1 pro表示;RCI=V3/V4。
1.6 肝脏组织线粒体膜肿胀度的测定 新鲜制备未冻融线粒体。反应缓冲液(250 mmol/L sucrose、5 mmol/L KH2PO4、3 mmol/L琥珀酸钠，pH 7.2)总体积为200 ml，含线粒体蛋白50 mg，混匀后记录520 nm处吸光度值，测定过程保持25℃恒温〔10〕。
1.7 线粒体膜电位(Δψ)的测定 Rhodamin 123为一种特异性的荧光染料，带有正电荷，可被线粒体摄取，其摄取率与膜电位呈正比。采用BMG 96孔板进行测定，每孔加入150 ml膜电位反应缓冲液(150 mmol/L蔗糖、5mmol/L MgCl2、5mmol/L琥珀酸钠、2.7 mmol/L 鱼藤酮、5 mmol/L KH2PO4、20 mmol/L Hepes，pH 7.4)和1 mmol/L Rhodamin 123 1 ml，先用激发波长485 nm、发射波长520 nm，37℃条件下测定基础荧光值，再加入50 ml线粒体蛋白悬液混匀，测定Rhodamin 123被线粒体摄取后的荧光值〔10，11〕。以Lowry法进行蛋白定量。
1.8 线粒体MDA含量、SOD活性和LDH活性检测 MDA测定采用硫代巴比妥酸法检测，SOD活性单位为每毫升反应液中抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位(U/ml)。具体操作步骤按试剂盒说明进行。
1.9 统计学处理 结果以x±s表示，各组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，结合Dunett′s test。
2 结 果
2.1 人参皂苷Rg1对快速老化小鼠线粒体呼吸功能的影响 见表1。与正常对照组比较，模型对照组肝脏线粒体NAD链Ⅲ态(R3)快速耗氧、呼吸控制率(RCR)、P/O、氧化磷酸化效率(OPR)显著降低(P<0.01，P<0.05)，Ⅳ态(R4)氧耗无显著变化。与SAMP8对照组比较，Rg1 10 和30 mg/kg均能显著改善线粒体呼吸功能障碍，显著提高R3、RCR、P/O和氧化磷酸化效率。 表1 人参皂苷Rg1对SAM小鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与模型对照组比较：3)P<0.05，4)P<0.01;下表同
2.2 人参皂苷Rg1对快速老化小鼠线粒体膜肿胀度和线粒体膜电位的影响 见表2。与正常对照组相比，模型对照组肝脏线粒体膜电位显著降低(P<0.05)。与模型对照组相比，人参皂苷Rg1(10、30 mg/kg)给药组呈剂量依赖性提高线粒体膜电位。人参皂苷Rg1低剂量组线粒体膜电位比模型对照组提高了15.0%(P<0.05);人参皂苷Rg1高剂量组线粒体膜电位比模型对照组提高了22.2% (P<0.01)。与正常对照组比较，模型对照组线粒体膜出现肿胀，肿胀程度增加了46.9%(P<0.01)。与模型对照组相比，人参皂苷Rg1低剂量组线粒体膜肿胀度比模型对照组降低了53.4% (P<0.01);人参皂苷Rg1高剂量组线粒体膜肿胀度比模型对照组提高了31.1%，但无统计学差异表2 人参皂苷Rg1对SAM小鼠肝脏线粒体膜电位和膜肿胀度的影响
2.3 Rg1对快速老化小鼠线粒体中MDA含量、SOD活性和LDH释放的影响 与正常对照组比较，模型对照组肝脏线粒体MDA含量显著增高(P<0.01)、SOD活性显著降低(P<0.01)，LDH释放显著增多(P<0.05)。与模型对照组比较，人参皂苷Rg1低剂量可显著抑制LDH的释放(P<0.05)，但对MDA含量和SOD活性的改变无显著性差异;人参皂苷Rg1高剂量对这些生化功能均具有显著性的改善作用(P<0.05)。见表3。 表3 人参皂苷Rg1对SAM小鼠肝脏线粒体
3 讨 论
线粒体是真核生物细胞中特别重要的细胞器，在能量代谢中发挥重要作用，是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心。RCR即呼吸控制率，也有人称为呼吸调节比，是表征线粒体结构、功能完整性及氧化磷酸化效率的指标。ADP/O是线粒体每吸收一克原子氧的同时，生成ATP 的克分子数的比值，反映线粒体的能量转化效率。RCR与ADP/O比值一起成为衡量线粒体结构完整与否及氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标。如果线粒体结构完整，功能正常，底物充分，电子传递形成的质子梯度不断被消耗，电子就得以顺畅的传递，氧气被快速消耗，测得的耗氧率会很大，这个时候称为态3呼吸。如果ADP耗竭，质子梯度就不能消耗。这时质子梯度的存在就成为电子传递的阻碍，电子传递变得缓慢，氧气的消耗也就变得很少，这时称为态4呼吸。这样的状态下，RCR值就会比较大。一般认为，RCR比ADP/O比值更能反映线粒体功能的完整性和氧化磷酸化的效率〔8，9〕。
研究表明，神经退行性疾病的发生与线粒体缺陷密切相关〔12〕。线粒体除了产生ATP供给细胞所需能量外，在细胞氧化还原状态、渗透压调节、钙稳态、pH值维持以及细胞信号转导中起重要作用。线粒体功能异常在神经退行性疾病中的作用多年来备受关注〔13，14〕，线粒体如不能有效地进行氧化磷酸化，细胞磷酸肌酸很快耗竭，同时释放出大量的无机磷，促进糖酵解及乳酸生成，导致细胞内pH值下降，细胞酸中毒，线粒体膜电位下降，随着缺血时间的延长，线粒体自身结构与功能会受到严重损害。机体除线粒体代谢功能下降，还表现在其形态结构的损害，如线粒体肿胀、基质丧失何致密物质沉积。本研究发现，快速老化小鼠线粒体功能明显下降，表现为呼吸功能降低，线粒体膜电位下降，线粒体氧化还原能力的异常损伤，同时线粒体结构也出现损害，表现为肿胀程度明显增加。本研究表明，人参皂苷Rg1能够改善快速老化小鼠的线粒体功能异常及其结构损伤，表现为改善线粒体呼吸功能，升高线粒体膜电位，改善线粒体氧化还原能力，减轻线粒体膜肿胀程度。
线粒体是细胞内产生活性氧的主要部位，线粒体在呼吸链电子传递过程中不断产生各种自由基，膜上又富含不饱和脂肪酸，使得线粒体成为自由基攻击的主要靶部位〔15〕。线粒体膜的过氧化损伤必将影响线粒体膜结构与功能的完整性，进一步影响整个细胞的正常生理功能，最终引起细胞功能的改变〔16〕。生理条件下线粒体内存在着有效的抗氧化机制(如SOD等)，可将代谢中产生的ROS及时清除，使脂质过氧化产物MDA生成减少，线粒体和神经元不致遭受过氧化损害。本研究表明，快速老化小鼠线粒体脂质过氧化产物MDA水平显著增加，SOD活性显著降低，LDH活性显著升高。说明快速老化后线粒体ROS大量产生且其抗氧化能力下降，使ROS不能及时得到清除，攻击线粒体内膜，从而导致线粒体结构和功能异常。表明快速老化小鼠的线粒体存在功能障碍，不仅导致周围组织过氧化损伤，也影响到线粒体膜本身。给予人参皂苷Rg1可显著改善快速老化小鼠肝脏线粒体生化功能的改变，降低线粒体膜MDA水平，提高线粒体SOD活性，降低LDH水平。
综上，人参皂苷Rg1可以通过提高线粒体的呼吸功能，改善线粒体结构和功能损伤，减轻脂质过氧化损伤，从而在AD的防治中发挥重要作用。
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