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T7噬菌体衣壳蛋白P11的原核表达、 纯化及其单克隆抗体的制备
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【中医学毕业小论文】【摘要】 目的: 表达、 纯化T7噬菌体衣壳蛋白P11, 并制备其单克隆抗体（mAb）。方法: 克隆并表达T7噬菌体P11蛋白, 其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠, 经融合、 筛选制备特异性mAb。结果: 成功表达了P11蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量（Mr）约为27 000。获得了1 株稳定分泌抗P11抗体的杂交瘤细胞株（2G11）, 其分泌的mAb的Ig亚类（型）为IgG2b。ELISA检测, 对应腹水mAb的效价为1∶8.1×105。Western blot结果显示抗P11mAb具有良好的特异性。结论: 成功地制备了P11蛋白及其mAb。
【关键词】 T7噬菌体 P11蛋白 核表达 单克隆抗体
T7噬菌体是一种感染大肠杆菌的烈性噬菌体［1］, 基因组为线状双链DNA, 长39 936 bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白PlOA、 次要头蛋白P1OB、颈圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17［2, 3］。T7噬菌体作为一种常见的展示系统［4-6］, 因其载体容量大, 插入片段稳定, 洗涤条件灵活, 生长周期短而被广泛使用。为进一步研究T7噬菌体尾蛋白P11蛋白结构和功能, 并为建立T7噬菌体快速准确的检测方法奠定基础, 我们进行了原核表达、 纯化P11蛋白并制备出具有良好特异性的mAb。
1 材料和方法
1.1 材料
质粒pET28a(+)、T7 select 103b control, 大肠杆菌Top10株, 大肠杆菌BL21（DE3）以及Sp2/0细胞均由本室保存。限制性内切酶Nde Ⅰ和BamH Ⅰ均购自大连宝生物公司。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。NiNTA HisBind resin购自Amersham公司。
HRP羊抗鼠IgG和Ig亚类（型）鉴定试剂盒Sigma公司产品。BALB/c小鼠由本研究所实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 重组原核表达载体的构建
以T7 select 103b control质粒为模板, 加入针对G11基因的特异引物进行PCR扩增。上游引物为: 5′ggaattccatatgatgcgctcatacgatatgaac3′（划线处为Nde I酶切位点）下游引物为: 5′cgggatccttagcgagtcagtagaccag3′（划线处为BamH I酶切位点）。扩增反应的条件为: 94℃变性5 min, 然后进行30个循环: 94℃ 30 s, 58℃ 45 s, 72℃ 60 s, 最后72℃延伸8 min。用胶回收试剂盒纯化PCR产物, 用Nde I和BamH I双酶切PCR产物和pET28a(+), T4 DNA连接酶连接并转化大肠杆菌Top10株 , 抽取质粒, Nde I和BamH I双酶切鉴定并测序确认正确, 成功构建重组表达载体pET28a(+)/G11。
1.2.2 重组P11蛋白的表达及纯化
将pET28a(+)/G11转化大肠杆菌BL21(DE3)。用异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）分别诱导表达4、 6、 8 h, 通过SDSPAGE 分析比较诱导前后结果。挑单克隆接种于含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中, 37℃震荡培养过夜, 按1∶100转接到200 mL培养基中, 37℃培养至A600为0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L, 30℃诱导表达4 h。收集菌液, 以8 000 r/min离心10 min收集菌体, 用缓冲液A（pH7.4、 20 mmol/L PB、 0.5 mol/L NaCl、 1 mmol/L PMSF）重悬细菌沉淀, 经超声破碎细菌后, 以12 000 r/min离心10 min。取上清, 采用DuoFlow系统（BioRad）NiNTA 亲和柱层析, 缓冲液B（pH7.4、 20 mmol/L PB、 0.5 mol/L NaCl、 0.5 mol/L imidazole）梯度洗脱。收集洗脱峰, 120 g/L SDSPAGE鉴定纯化效果。
1.2.3 动物免疫
用400 μL纯化的p11蛋白（1.0 g/L）稀释于6 000 μL PBS（0.1 mol/L PB、 0.15 mol/L NaCl）并与等量完全弗氏佐剂混合充分乳化, 多点皮下注射免疫BALB/c小鼠（50 μg/只）。1个月后, 经腹腔注射加强免疫, 用不完全弗氏佐剂充分乳化抗原, 注射剂量同前, 后每隔2周分别进行第3次和第4次加强免疫。
1.2.4 细胞融合与抗体制备
ELISA法检测抗血清的效价, 取效价最高的老鼠, 脾内注射10 μg抗原加强免疫, 4 d后, 取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合［7］。用间接ELISA法［8］筛选阳性杂交瘤细胞株。经3次有限稀释法克隆化后, 选择1株mAb持续分泌阳性的杂交瘤细胞并扩大培养准备腹腔注射小鼠。接种杂交瘤细胞前1周, 小鼠腹腔注射0.5 mL液体石蜡。接种时离心收集杂交瘤细胞, 用不完全培养液悬浮并混匀, 将细胞数调至(1～2) ×109/L, 每只小鼠腹腔注射0.5 mL, 1周后小鼠腹部明显肿胀, 消毒下腹部皮肤后, 抽取腹水, 获得腹水经3 000 r/min离心15 min, 收集上清。硫酸铵法初步纯化腹水, 以用于后续检测。
1.2.5 mAb的效价和亚类鉴定
①效价测定: 采用间接ELISA法。用PBS稀释10 μL P11蛋白（1 mg/L）包被聚苯乙烯板。一抗为稀释的腹水样本, 二抗为1∶1 000的HRP羊抗鼠IgG, 经ABTS底物显色后, 于波长405 nm测定A值。②Ig亚类（型）的鉴定：间接ELISA法（参照试剂盒的说明书进行）。③特异性鉴定: Western blot分析, 纯化后的P11融合蛋白SDSPAGE后, 电转移至硝酸纤维素(NC)膜上, 转移后的NC膜于封闭液中封闭过夜后, 先与抗P11的mAb反应过夜, 再与HRP标记的羊抗鼠IgG 37℃孵育2 h, 经显色液显色后压片观察结果。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定
重组表达质粒pET28a(+)/G11经Nde I和BamH I酶切后分别出现5927、 598 bp的电泳条带（图1）, 与预期大小相符, 测序结果与文献发表的序列一致, 未发现突变碱基存在, 说明重组原核表达载体构建正确。
2.2 G11基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和纯化
将重组表达质粒pET28a(+)/G11转化大肠杆菌BL21（DE3）后, 经IPTG诱导表达表达4、6和8 h。表达产物经SDSPAGE后, 在Mr约27000处可见1条明显的蛋白带（图2）。该蛋白的氨基端带有Histag, 大量诱导表达Ni2+柱亲和层析纯化后, 用BCA法定量, 可溶性表达蛋白含量为1.0 mg/L。
2.3 抗P11蛋白mAb的制备和初步鉴定
血清抗体效价最高的免疫小鼠的脾细胞进行融合, 结果筛选到1株阳性克隆, 命名为2G11。经ELISA检测, 1株mAb腹水的效价为1∶8.1×105。其Ig亚类为IgG2b、 Western blot结果显示, 在Mr为27 000处T7噬菌体蛋白和重组P11蛋白有一明显条带, 而未经诱导菌体蛋白、 P10his蛋白和T4噬菌体蛋白则无此反应（图3）。
3 讨论
本实验中我们构建了原核表达载体pET28a(+)/G11, 鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达羧基端含6×His标签的可溶性融合蛋白。利用6×His标签和镍离子特异性螯合的特性纯化, 得到高纯度的目的蛋白。以纯化P11 蛋白为抗原, 通过杂交瘤技术成功获得了抗P11的mAb
。
T7噬菌体具有的强大的外源蛋白或多肽展示能力, 已经被广泛应用于cDNA文库展示, 如最近就有人利用T7噬菌体展示前列腺癌组织的cDNA文库［9］, 然后利用文库技术与噬菌体芯片技术结合找到了一些前列腺癌的自身抗原及自身抗体。在实际工作中, 我们发现制备T7噬菌体芯片时, 需要对展示不同多肽的噬菌体进行定量检测（未发表资料）, 如果能够首先在芯片上点上抗T7噬菌体的抗体, 然后再点上T7噬菌体, 那将有望使芯片上的T7噬菌体较均一; 而且由于P11位于T7噬菌体的尾部（图4）, 这样的点样方式, 也将使融合于P10的蛋白或多肽更加有效的展示, 进而使筛选更加有效。
此外, 关于T7噬菌体尾蛋白P11参与包装的具体过程和机制尚不完全清楚, 还需要更多研究。另外, T7噬菌体实验室污染已经引起普遍关注, 噬菌斑法是检测噬菌体最常用方法, 其局限性在于不能将其他噬菌体与T7噬菌体加以区分。到目前为止, 尚未见制备针对P11mAb的报道。本实验室首次制作的T7噬菌体P11 mAb为进一步研究T7 Phage的结构与功能, 并为建立T7噬菌体快速准确诊断方法奠定基础。
【参考文献】
［1］徐晋麟, 徐 沁, 陈 淳. 现代遗传学原理［M］. 北京: 科学出版社, 2007, 125.
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［6］Jiang J, AbuShilbayeh L, Rao VB. Display of a PorA peptide from Neisseria meningitidis on the bacteriophage T4 capsid surface［J］. Infect Immun, 1997, 65(11): 4770-4777.
［7］余 抒, 罗 萍, 陈洪章, 等. 抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(7): 657-659.
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［9］Wang X, Yu J, Sreekumar A, et al. Autoantibody signatures in prostate cancer［J］. N Engl J Med, 2005, 353(12): 1224-1235.ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2008, 24(5)··论著·
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