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从环氧化酶和5脂氧化酶途径探讨虎杖痛风颗粒的抗炎机制
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【主管药师论文】作者：王一飞, 吴文静, 张明, 周敏, 李斌【摘要】 目的：观察虎杖痛风颗粒对环氧化酶（cyclooxygenase，COX）和5脂氧化酶（5lipoxygenase，5LOX）活性的影响，探讨虎杖痛风颗粒抗炎的可能机制。方法：健康志愿者全血标本加入钙离子载体A23187予以刺激，以阿司匹林为对照，通过酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法检测血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）含量考察不同浓度的虎杖痛风颗粒溶液对COX1活性的影响；健康志愿者全血经阿司匹林灭活COX1后，予脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后，以塞来昔布为对照，通过ELISA检测前列环素I2（prostaglandin I2，PGI2）含量考察不同浓度虎杖痛风颗粒溶液对COX2活性的影响；大鼠皮下植入含0.5%花生四烯酸溶液的棉球，收集渗液中的多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN），采用反相高效液相色谱法测定白细胞三烯B4（leukotriene B4，LTB4）含量考察不同剂量虎杖痛风颗粒对5LOX活性的影响。结果：低浓度虎杖痛风颗粒组TXB2浓度较高浓度虎杖痛风颗粒组和阿司匹林组升高（P＜0.05）；高、低浓度虎杖痛风颗粒组PGI2浓度较塞来昔布组明显升高（P＜0.05），高、低浓度虎杖痛风颗粒组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；空白对照组LTB4含量较高、低剂量虎杖痛风颗粒组和地塞米松组高（P＜0.05）。结论：虎杖痛风颗粒能通过抑制COX和5LOX的活性减少TXB2、PGI2和LTB4等炎症介质的释放。
【关键词】 痛风性关节炎; 虎杖痛风颗粒; 环氧化酶; 5脂氧化酶
Objective: To observe the effects of Huzhang Gout Granule (HZGG), a compound traditional Chinese herbal medicine, on cyclooxygenase (COX) and 5lipoxygenase (5LOX) activities, the two important oxidases in the course of inflammation, so as to investigate the possible antiinflammatory mechanism of HZGG.
Methods: After stimulating the blood sample of healthy volunteer with calcium ionophore A23187, concentration of thromboxane B2 (TXB2) in the healthy volunteer’s blood was detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) to observe the effects of HZGG at low and highdose on the activity of COX1, with aspirin as control drug. The concentration of prostaglandin I2 (PGI2) in the healthy volunteer’s blood sample, in which aspirin was added to destroy activity of COX1 beforehand and which was stimulated with lipopolysaccharide, was detected by ELISA method to observe the effects of HZGG on the activity of COX2, with celecoxib as control drug. In the animal experiment, 40 rats were implanted with sponges soaking in 0.5% arachidonic acid solution in the back to induce inflammatory effusion. Content of leukotriene B4 (LTB4) in the polymorphonuclear leukocytes (PMNs) from the inflammatory effusions was detected with reversedphase highperformance liquid chromatography (RPHPLC) to observe the impacts of different doses of HZGG on the activity of 5LOX, with dexamethasone as control drug.
Results: The concentration of TXB2 in the lowdose HZGG group was higher than those in the highdose HZGG group and the aspirin group (P＜0.05). The concentrations of PGI2 in the low and highdose HZGG groups were higher than that in the celecoxib group (P＜0.05), but there was no significant difference between the lowdose HZGG group and the highdose HZGG group (P＞0.05). The content of LTB4 in the blank control group was higher than those in the lowdose HZGG group, the highdose HZGG group or the dexamethasone group (P＜0.05).
Conclusion: HZGG can reduce the releasing of inflammatory mediators, such as TXB2, PGI2 and LTB4, by inhibiting the activities of COX and 5LOX.
Keywords: acute gouty arthritis; Huzhang Gout Granule; cyclooxygenase; 5lipoxygenase
急性痛风性关节炎是由尿酸钠微晶体诱发，中性粒细胞介导的炎症。血栓素（thromboxane，TX）、前列环素（prostaglandin，PG）和白细胞三烯（leukotriene，LT）是这一炎症过程中重要的炎症介质，它们都是细胞膜成分花生四烯酸通过环氧化酶（cyclooxygenase，COX）途径或5脂氧化酶（5lipoxygenase，5LOX）途径代谢而来的，而现有治疗急性痛风性关节炎的药物主要是通过拮抗上述炎症介质代谢过程中关键酶的活性而起效的。在传统非甾体类抗炎药（nonsteroidal antiinflammatory drug，NSAID）无法回避的不良反应面前，中药复方制剂无论从疗效还是不良反应来说都有其独特的优势。虎杖痛风颗粒（Huzhang Gout Granule，HZGG）是上海中医药大学岳阳中西医结合医院痛风专科治疗急性痛风性关节炎的院内制剂，临床和动物实验研究证实其具有抗炎、镇痛、拮抗痛风急性发作等功效，且未见明显毒副作用［1，2］，但是其具体通过何种途径发挥了上述临床效应，机制尚不清楚。本实验从花生四烯酸代谢的COX和5LOX途径入手，探讨虎杖痛风颗粒对COX1、COX2及5LOX活性的影响，试图阐明其抗炎和拮抗痛风的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 健康志愿者选择 选择健康体检者，共有7人，其中男性5人，女性2人，平均年龄29.57岁，均为上海中医药大学岳阳中西医结合医院痛风专科符合条件的工作人员、研究生及实习生，并征得本人同意。既往无抗痛风药物过敏史，在采血前两周内未服过任何药物，血、尿常规，肝、肾功能，血压和心电图等检查均正常。
1.1.2 实验动物 选用雄性健康Wistar大鼠40只，体质量（200±20）g，清洁级，购自上海医药工业研究院实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（沪）20040007，动物使用许可证号为SYXK（沪）20040015。
1.1.3 药物和试剂 虎杖痛风颗粒，由虎杖、羌活、当归、茵陈、黄柏、苍术、茯苓、川牛膝、猪苓、泽泻组成，由上海中医药大学岳阳中西医结合医院药剂科制剂室生产成干膏粉，每克干膏粉生药含量为7.55 g，批准文号为沪药制字Z05050327；阿司匹林片，由上药集团信谊制药总厂生产，25 mg/片，批准文号为国药准字H31022475；塞来昔布胶囊，由辉瑞制药有限公司生产，200 mg/粒，批准文号为国药准字J20030098；醋酸地塞米松注射液，由上海通用药业股份有限公司生产，5 mg/支，批准文号为国药准字H31021399。分析柱Nucleosil C18小柱、乙酸、石油醚、无水乙醇、甲酸甲酯、TrisHCl缓冲液、磷酸缓冲液，由上海试剂一厂生产；钙离子载体A23187、脂多糖、花生四烯酸油剂、前列环素B2（prostaglandin B2，PGB2）等，由美国Sigma公司生产；血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）和前列环素I2（prostaglandin I2，PGI2）酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）检测试剂盒，由美国ADL公司生产。
1.1.4 主要仪器与设备 高效液相色谱仪(PerkimElmer公司)，LQ300K酶标仪（Epson公司），115K高速冷冻台式离心机（德国Sigma公司），CO2培养箱（长沙长锦科技有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 TXB2含量检测 参考文献方法［3］。抽取健康志愿者全血6 mL，肝素(19 U/mL)抗凝，加入每孔包埋有50 μmol/L钙离子载体A23187的培养板予以刺激，每孔100 μL。6孔为空白对照，其余再设14孔为阿司匹林组（每孔加入0.5 mL 100 μmol/L阿司匹林溶液），14孔为高浓度虎杖痛风颗粒组（每孔加入浓度为0.6 g/mL的虎杖痛风颗粒干膏粉溶液0.5 mL），14孔为低浓度虎杖痛风颗粒组（每孔加入浓度为0.3 g/mL的虎杖痛风颗粒干膏粉溶液0.5 mL）。将上述加样完整的培养板放置于37 ℃、5% CO2培养箱培养30 min。在4 ℃条件下以2 000 r/min离心5 min，吸取上清液，－80 ℃冷冻备用。按ELISA试剂盒说明书方法操作测定上清液中TXB2含量。
1.2.2 PGI2含量检测 抽取健康志愿者全血6 mL，以19 U/mL肝素抗凝，加入每孔包埋有50 μmol/L LPS的培养板予以刺激，每孔加入全血100 μL。每孔加入浓度为72 mg/L的阿司匹林溶液50 μL，37 ℃、5% CO2培养箱培养6 h，灭活COX1。6孔作空白对照孔，14孔为塞来昔布组（每孔加入浓度为100 mg/L的塞来昔布溶液0.5 mL），14孔为高浓度虎杖痛风颗粒组（每孔加入浓度为0.6 g/mL的虎杖痛风颗粒干膏粉溶液0.5 mL），14孔为低浓度虎杖痛风颗粒组（每孔加入浓度为0.3 g/mL虎杖痛风颗粒干膏粉溶液0.5 mL）。将上述加样完整的培养板放置于37 ℃、5% CO2培养箱培养18 h。在4 ℃条件下2 000 r/min离心5 min，吸取上清液，－80 ℃冷冻备用。按ELISA试剂盒说明书方法操作测定上清液中PGI2含量。
1.2.3 LTB4含量检测
1.2.3.1 实验分组 大鼠40只，驯养1周后，随机分为空白对照组（蒸馏水）、地塞米松组（3.38 mg/L，相当于成人剂量）、低剂量虎杖痛风颗粒组（0.25 g/mL，相当于成人剂量）、高剂量虎杖痛风颗粒组（0.50 g/mL，相当于2倍成人剂量），每组10只。大鼠开架分笼饲养，每笼5只，恒温（22±2）℃，人工照明，12 h明暗交替，24 h自由饮水、进食，并定期清洁、消毒。
1.2.3.2 模型制备 采用大鼠皮下棉球植入法致炎［4］。取适量棉球，每枚质量(60.0±0.02)mg，用70%乙醇浸泡30 min，蒸馏水冲洗4次后，80 ℃加热2 h。植入前将棉球浸泡在0.5%花生四烯酸溶液中备用。大鼠背部正中备皮后，按0.1 mL/kg标准用3%司可巴比妥（速可眠）麻醉大鼠，5～10 min后麻醉成功。在大鼠背部备皮区切开一纵行切口，长约3 cm，在皮下钝性分离出一空隙，植入花生四烯酸棉球1枚，缝合切口。按10 mL/kg标准，给予高、低剂量虎杖痛风颗粒组，地塞米松组，空白对照组大鼠灌服指定药物，分别于造模前、后2 h灌胃。
1.2.3.3 多形核白细胞细胞悬液制备 棉球植入9 h后，取出棉球收集渗出液，立即4 ℃、3 000 r/min离心10 min，弃去上清，将沉淀的细胞液悬浮于TrisHCl缓冲液中，溶解红细胞，再以3 000 r/min离心5 min，磷酸缓冲液洗涤2次，将白细胞悬浮于TrisHCl缓冲液中，细胞密度为5×106个/mL，锥虫蓝染色后计数，存活细胞＞95%，提示多形核白细胞悬液制备成功。
1.2.3.4 反相高效液相色谱法测定LTB4含量 取多形核白细胞悬液1 mL，加入钙离子载体A23187（终浓度为2×10－6 mmol/L），于37 ℃下振荡温育5 min，加入2 mL无水乙醇终止反应，再加入0.5 μg内标物PGB2和适量蒸馏水，使样品中乙醇浓度为10%，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，上清液用1 mol/L HCl溶液调整pH至3.0。反相SEPPAK C18柱（美国Waters公司生产）一端连20 mL注射器，将甲醇和蒸馏水各20 mL依次压过小柱清洗。样品上柱后，顺次以10%乙醇、蒸馏水和石油醚各20 mL冲洗小柱，最后用10 mL甲酸甲酯将花生四烯酸代谢产物从柱上洗脱下来，洗脱液于氮气流下蒸干，加含50 μg甲醇的洗脱液溶解备用。取10 μL进样，采用反相高效液相色谱，选择PGB2为内标，色谱柱为Nucleosil C18小柱（颗粒直径5 μm），流动相为甲醇︰蒸馏水︰乙酸(70︰30︰0.01)，用氨水将pH调至5.7，采用线形梯度洗脱，流速为1 mL/min。紫外检测波长为280 nm，LTB4的定量根据吸收峰面积与内标物PGB2峰面积之比计算。
1.3 统计学方法 所得数据采用SPSS 12.0 for Windows软件统计分析，计量资料数据以x±s表示，检验水准α=0.05。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，如方差不齐时采用Tamhane’s方法进行校正，如有统计学意义则采用LSDt检验进一步行两两比较。
2 结果
2.1 健康人血清结果
2.1.1 虎杖痛风颗粒对血浆TXB2浓度的影响 低浓度虎杖痛风颗粒组有一反应孔无颜色变化，无法读数，其余均可读数。高浓度虎杖痛风颗粒组、低浓度虎杖痛风颗粒组及阿司匹林组TXB2浓度组间两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。TXB2浓度大小依次为低浓度虎杖痛风颗粒组＞高浓度虎杖痛风颗粒组＞阿司匹林组。见表1。
2.1.2 虎杖痛风颗粒对PGI2浓度的影响 低浓度虎杖痛风颗粒组有一孔颜色无法读数，其余均可读数。高、低浓度虎杖痛风颗粒组PGI2浓度均高于塞来昔布组（P＜0.05）；高浓度虎杖痛风颗粒组PGI2浓度低于低浓度虎杖痛风颗粒组，但两组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。
表1 各组血浆TXB2浓度（略）
Table 1 TXB2 concentration in plasma in different groups
*P＜0.05, vs aspirin group; △P＜0.05, vs lowdose HZGG group.
表2 各组血浆PGI2浓度（略）
Table 2 PGI2 concentration in plasma in different groups
▲P＜0.05, vs celecoxib group.
2.2 动物实验结果
2.2.1 大鼠一般情况观察 造模中无大鼠死亡。除空白对照组大鼠精神较萎靡，少动，进食少之外，其余3组大鼠精神均可，反应灵敏，皮毛白、致密而有光泽，饮食、粪便均无异常。高剂量虎杖痛风颗粒组及地塞米松组大鼠背部伤口处皮肤轻度肿胀，皮温基本正常，肤色略红，按压该处，无浆液性或脓性渗出，有少量血性渗出，大鼠可正常进食或休息；空白对照组背部造模处皮肤肿胀明显，肤色红，皮温高，按压该处，有浆液性渗出，且大鼠反应剧烈，表现为逃脱、闪躲；低剂量虎杖痛风颗粒组大鼠造模局部皮温略高，肤色鲜红不甚，按压该处，未见明显浆液性或脓性渗出，有血性渗出。
2.2.2 虎杖痛风颗粒对LTB4的影响 LTB4的定量根据吸收峰面积与内标物PGB2峰面积之比计算，面积大者含量高。LTB4的吸收峰出现第6分钟，空白组及低剂量虎杖痛风颗粒组在第6分钟处的吸收峰高而宽（图1B、D），而地塞米松组和高剂量虎杖痛风颗粒组在第6分钟处的吸收峰几乎无法观察到（图1C、E）。经换算，任意两组间的LTB4面积比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各组LTB4的面积大小依次为空白对照组＞低剂量虎杖痛风颗粒组＞高剂量虎杖痛风颗粒组＞地塞米松组。见表3。
表3 各组样本LTB4面积值（略）
Table 3 Area of LTB4 in different groups
*P＜0.05, vs blank control group; △P＜0.05, vs lowdose HZGG group; □P<0.05, vs dexamethasone group.
3 讨论
A23187是一种钙离子载体，能促使细胞膜中的钙离子通路开放，增加细胞内钙离子的浓度，通过细胞信号转导的方式使得COX1活性升高，从而引起全血中TXB2的释放。阿司匹林能通过抑制COX1活性减少TXB2的释放，因此可以通过测定体系中TXB2的含量来考察干预物对COX1的活性或表达是否存在影响及其影响程度。实验结果显示，TXB2浓度大小依次为低浓度虎杖痛风颗粒组＞高浓度虎杖痛风颗粒组＞阿司匹林组（P＜0.05）。
对动物关节炎模型的研究发现，前列腺素含量的增加是由于COX2的表达上升所引起的，在离体培养的骨关节炎病人滑膜细胞中能检测到高水平的COX2和前列腺素［5］。炎症因子（如脂多糖、白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等）能诱导COX2的高表达，而白细胞介素4、白细胞介素13等抗炎因子和免疫抑制剂糖皮质激素能降低COX2的水平［6］。在经过阿司匹林预处理后，人全血样本中的COX1被大部分灭活，因此由脂多糖刺激的PGI2释放可以被视为是COX2表达增加或活性升高的结果。而COX2的活性又能被COX2选择性抑制剂塞来昔布特异性地抑制，从而减少PGI2的释放，故而可以通过测定体系中PGI2的含量来考察干预物对COX2的活性或表达是否存在影响及其影响程度。实验结果表明，高、低浓度虎杖痛风颗粒组的PGI2浓度均高于塞来昔布组（P＜0.05），虽然数据显示低浓度虎杖痛风颗粒组PGI2浓度高于高浓度虎杖痛风颗粒组，但两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。因此可以推断，塞来昔布对COX2的活性或表达的抑制能力强于虎杖痛风颗粒，高剂量虎杖痛风颗粒对COX2的活性或表达的抑制能力具有强于低剂量虎杖痛风颗粒的趋势。
图1 高效液相色谱法观察各组LTB4吸收情况（略）
Figure 1 Absorbance of LTB4 in different groups observed by HPLC
A: Internal standard of PGB2; B: Blank control group; C: Dexamethasone group; D: Lowdose HZGG group; E: Highdose HZGG group.
人体内的花生四烯酸除了由COX催化代谢产生PG外，还可由5LOX催化产生LT。在NSAID抑制COX活性，阻断PG生物合成的同时，由5LOX催化的代谢产物LT生成将相对增加。它们能增加血管渗透性，趋化各类粒细胞而促进炎症反应的发生和发展进程。其中，LTB4是中性粒细胞和巨噬细胞强有力的趋化因子，在关节炎、哮喘、过敏性皮肤病中起着重要作用［7］，是花生四烯酸的氧化旁路5LOX途径中的主要炎症介质。而糖皮质激素地塞米松有强大的抗炎作用，能有效地抑制包括5LOX途径在内的各种途径产生的炎症因子，因此通过测定致炎大鼠病变部位渗出液内PMN中LTB4的生成量，即可以考察干预物对于5LOX的活性或表达是否存在影响及其影响程度。实验结果显示，低剂量虎杖痛风颗粒组和高剂量虎杖痛风颗粒组LTB4的吸收面积大于地塞米松组（P＜0.05），而小于空白对照组，可以推断，虎杖痛风颗粒具有抑制5LOX活性或表达的作用。
本实验表明，虎杖痛风颗粒可在一定程度上同时抑制COX1、COX2和5LOX的活性或表达，从而减少了TXB2、PGI2和LTB4等炎症介质的释放，进而有效的缓解了炎症，这或许是虎杖痛风颗粒拮抗痛风效应的机制之一。国外的相关研究也证实，COX/5LOX双重抑制剂较之单一的炎症介质抑制剂更能取得令人满意的疗效［8］。同时，相较于传统NSAID，其在抗炎同时较少地破坏COX1的生理性功能，因此患者耐受性良好，这一点也已被我们的临床研究所证实［9］。本实验还发现虎杖痛风颗粒的抗炎作用强度还与剂量有关，这提示我们，若在常规剂量下患者临床症状较重或控制不理想时，在一定的安全范围内可适当放宽服用虎杖痛风颗粒的剂量或频次，从而达到较高的血药浓度以提高抗痛风疗效。因此摸索最佳剂量和安全性之间恰当的平衡关系将是我们下一步临床探索的一个方向。
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