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孕妇外周血胎儿细胞的富集技术及其在产前诊断中的应用其它医学
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【中药学大专毕业论文】羊膜穿刺和绒毛吸取是 目前 常用的产前诊断技术，但其操作具有创伤性，可导致宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿畸形或死亡等［1］。建立非创伤性产前诊断 方法 ，降低产前诊断的风险，是产前诊断工作的一项重大课题。自50年代从孕妇外周血中发现胎儿细胞后，学者们开始关注这类细胞在产前诊断中的 应用 价值，但因技术条件的限制，这一非创伤性诊断方法进展缓慢。直至80年代中期，随着胎儿细胞分离技术的日趋成熟和分子生物学、细胞遗传学诊断技术的迅猛 发展 ，这一产前诊断方法才有了新的突破，并成为近十年来众多学者 研究 的热点，现综述如下。
1 胎儿细胞的特征和消长 规律
1.1 类型
目前从孕妇外周血分离到的胎儿细胞有滋养叶细胞、淋巴细胞和有核红细胞(NRBC)。因滋养叶细胞体积大、容易在肺组织滞留；淋巴细胞出现晚，存活时间长(半年～27年)，在下次妊娠时妇女血液中可再次出现［2］，其应用价值不大。
NRBC是用于产前诊断最理想的胎儿细胞，它有如下特征：(1)可在妊娠早期出现，寿命短(不超过90天)，便于早期诊断［3］；(2)可表达出特殊的抗原成分，便于富集；(3)可发生特殊的血红蛋白反应，便于鉴定［4］；(4)携带胎儿全部基因组，便于遗传学和分子生物学 分析 。
1.2 抗原性
胎儿细胞的抗原性是鉴定、富集胎儿细胞的生物学基础，现已证实，胎儿NRBC有4种特殊的抗原成分：转铁蛋白受体(CD71)、凝血酶敏感蛋白受体(CD36)、糖蛋白A(GPA)和红细胞膜蛋白［5-7］。最近Steele等［8］又从孕妇外周血中发现HLA-G mRNA基因信号，提示HLA-G很可能是胎儿NRBC的另一抗原标志。
1.3 消长规律
探讨胎儿细胞的消长规律有助于选择产前诊断的最佳时间。Tomas等［9］发现人工受精的妇女血液检出Y染色体特异性序列的时间为4周零5天，最迟50天，首次检出的平均时间为6周±4天，消失时间为产后2个月。Simpson等［10］研究发现，从孕妇外周血分离胎儿NRBC的最佳时间为妊娠后10～18周。马旭等［11］发现19例妊娠男胎妇女外周血Y染色体锌指蛋白基因(ZFY)在妊娠6周、11周、14周时的检出率分别为5.3%、68.4%和95.0%，同时还发现妊娠女胎的妇女外周血无1例ZFY假阳性，提示分离胎儿NRBC进行产前诊断的最佳时间为妊娠14周。
1.4 含量
胎儿NRBC含量高低关系到产前诊断的准确性。众多的研究表明，胎儿细胞与母体在细胞之比为1∶5000～1∶20 000，其中胎儿NRBC的比例在1∶105～1∶109之间。从 理论 上，只要有理想的富集、分析方法，胎儿NRBC含量完全可以满足诊断需要。
2 胎儿细胞的富集
纯度和产量是衡量胎儿细胞富集效力的两个重要概念，纯度是指分离后样本内胎母细胞百分比，产量是指实际获得的胎儿细胞数，不同方法对富集胎儿细胞的纯度和产量有很大 影响 ，现就现有的富集方法分述如下。
2.1 密度梯度离心法
利用聚蔗糖与泛影酸钠混合物作分离介质，加至孕妇血中离心，根据细胞密度的差异分离出胎儿细胞。该法简便易行，但胎儿细胞的纯度和产量不高。宋杰等［12］用此法分离胎儿细胞预测胎儿性别的灵敏度和特异度分别为84.85%和96.77%，总符合率为90.63%。
2.2 γ珠蛋白阳性选择法
胎儿血红蛋白主要为HbF，而成人为HbA。HbF由两条α珠蛋白和两条γ珠蛋白链组成；HbA由两条α珠蛋白和两条β珠蛋白链组成。利用抗γ珠蛋白的单克隆抗体通过流式细胞计数仪可富集胎儿NRBC。Zheng等［3］证实83%～100%抗γ珠蛋白阳性细胞为孕妇血液中的胎儿细胞。
2.3 荧光激活细胞分类法
又称流式细胞计数仪分离法 。先制备单核细胞悬液，用荧光素激活胎儿NRBC，利用流式细胞计数仪将胎儿NRBC从孕妇血液中分 离出来。Bianchi等［5］用荧光素标记抗CD71、CD36、GPA抗体后分离胎儿NRBC，再用PCR进行Y染色体序列分析，发现单独用抗CD71、CD36富集胎儿NRBC诊断胎儿性别的准确度分别为57%和88%，而单独用抗GPA或同时使用抗CD71、CD36富集胎儿NRBC诊断胎儿性别的准确度为100%。Wachtel等［14］和国内学者李智等［15］研究也有相似的结论。提示使用的抗体不同对分离胎儿细胞的纯度和产量有很大影响。
2.4 磁性激活细胞分类法
利用磁珠吸附胎儿NRBC，在磁场作用下将胎儿NRBC从孕妇血液中分离出来，包括以下两种方法。
2.4.1 磁场正相富集 又称磁场阳性富集。孕妇血液经密度梯度离心制备单细胞悬液，加入磁珠标记的单克隆抗体与胎儿NRBC结合，在磁场作用下阳性吸附NRBC，洗涤并振荡后获取胎儿NRBC。该法简便易行，但富集胎儿NRBC的含量和纯度不高。
2.4.2 磁场双相富集 孕妇血单细胞悬液中加入CD14和CD45单克隆抗体，使之与淋巴细胞和非红细胞单核细胞结合，再加入磁珠标记的羊抗鼠IgG，在磁场作用下吸附并去除淋巴细胞和非红细胞单核细胞(反相富集或阴性选择)；剩余物中加入CD71单克隆抗体，使之与胎儿NRBC反应，再次加入磁珠标记的羊抗鼠IgG，在磁场作用下吸附胎儿NRBC(正相富集或阳性选择)，洗涤振荡，获取胎儿NRBC。该法虽操作复杂，但获取的胎儿NRBC产量和纯度很高。Steel等［8］运用该技术可从18ml孕妇血液中获取3×104个胎儿NRBC，胎母细胞比在1∶3000～4∶3000之间。
3 临床应用
现已从基因和染色体水平对孕妇外周血胎儿细胞作产前诊断。在基因水平主要是用PCR鉴别胎儿性别、研究胎儿β-地中海贫血、Rh血型和HLA多态性。在染色体水平主要是用荧光原位杂交(FISH)诊断21三体、18三体、Klinefelter综合征和47，XXY等染色体病。
3.1 预测胎儿性别
用孕妇外周血胎儿细胞Y染色体PCR分析预测胎儿性别始于1989年［16］。4年后，Lo等［17］又报道了用妊娠早、中期原血作Y染色体序列分析的结果，发现7例男胎有6例预测正确，6例女胎有5例预测正确，只要300 000个母体细胞中含有1个胎儿细胞，就能成功地预测胎儿性别。现已证实，胎儿NRBC经GPA抗体吸附磁场分离后，PCR预测胎儿性别的准确度和特异度可达100%［5］。目前国内的研究和应用也日趋成熟，已有许多成功的先例［12，18］，接近国际先进水平。
3.2 预测Rh血型
多数情况下，Rh(D)阴性源于1号染色体Rh(D)基因缺失，若从Rh阴性血液中检出Rh(D)基因，则提示胎儿Rh血型阳性。Lo等［19］用妊娠晚期母体原血预测胎儿Rh血型取得成功。最近Geifman-Holtzman等［20］发现，妊娠早期母体血液富集胎儿NRBC后，用PCR预测Rh血型的特异度和敏感度分别为100%和84%，运用该法判断Rh(D)血型时常会出现血清学与PCR结果不符的 问题 。一方面，无Rh(D)抗原表达的人仍可能持部分Rh(D)基因片段，若扩增选在该区域内，会出现假阳性结果；另一方面，有人虽能表达Rh(D)抗原，但当扩增区域位于缺少的外显子内或样品不含胎儿细胞时，则出现假阴性结果。
3.3 诊断单基因遗传病
1990年Camaschells等［21］最早用孕妇外周血诊断胎儿β-地中海贫血/Hb Lepor病获得成功。他们对3例高危孕妇在妊娠8～10周的血液进行11号染色体Lepore突变基因PCR分析，发现2例预测正确，第3例孕妇血液Lepore基因阴性，其丈夫携带正常的Hb基因。从理论上讲，只要能够建立有效的胎儿细胞富集技术和PCR检测手段，许多单基因病的非创伤性产前诊断都能迎刃而解。
3.4 诊断染色体病
< br> 1991年Price等［22］首次用胎儿细胞诊断出1例18三体妊娠。作者用妊娠10周孕妇血液分离胎儿NRBC，用X、Y和18号染色体专一性探针作FISH，发现胎儿NRBC大部分出现以上3种染色体杂交信号，后经绒毛活检证实诊断正确。作者又用同样的方法诊断出1例21三体妊娠。Elias等［23］用CD71 GPA单克隆抗体磁场富集胎儿NRBC，用X、Y、18和21号染色体专一性探针作FISH，共研究了69名孕妇外周血，8例非整倍体妊娠只有1例未被检出，而且无1例假阳性。有人用同样方法诊断出13三体综合征［8］。
从孕妇外周血分离胎儿细胞进行产前诊断已取得了重要进展，但其临床应用中的问题仍需要进一步的研究，如富集胎儿细胞的最佳时间，影响因素，建立特异而敏感的基因、染色体分析方法，克服假阴性、假阳性问题等。只有解决好这些问题，这种方法才能成为理想的非创伤性产前诊断方法。
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