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β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定

【防疫医学论文】作者:邱文洪 吴丽娜叶 许楚娟 易路阳 郭凯文【摘要】 目的: 构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β半乳糖苷结合凝集素9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明β半乳糖苷结合凝集素9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体pGal9。
【关键词】 Gal9; 构建; 真核表达载体
半乳糖凝集素家族(galectin family)成员参与了许多生理和病理过程,包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等[1,2]。β半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白,属于半乳糖凝集素家族(galectin family)成员,组织分布广泛,在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面,发挥着重要作用[3]。目前对Gal9发挥作用的具体机制仍知之甚少,值得进一步深入探讨和研究,从而使Gal9作为疾病治疗的新的靶点成为可能。为此,本研究拟通过构建表达人Gal9蛋白的真核表达载体,为进一步研究Gal9的作用机制打下基础。
  1 材料和方法
1.1 材料
T4连接酶、限制性内切酶(MBI),Taq酶和RT试剂盒(Promega),RNA提取试剂盒(Invitrogen),质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒(Qiagen),DNA marker(Tiangen),Trizol、1640培养基,人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),Galectin9引物(英骏生物技术有限公司)。
1.2 引物设计
参照GenBank上Gal9(NM009587.2)序列设计引物如下:上游引物:P1 5'CCAAGCTTGGGTTAAGTCGTTCCCTCTACAA 3',下游引物:P2 5'CGGAATTCCGAGGACCCAGACTGCCCCAC 3',下划线分别为HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,扩增Gal9的CDS序列,共1176 bp。
1.3 分离人外周血单个核细胞
静脉取血,加入肝素溶液(10~50u/m1血样本)抗凝,用pH7.2 Hanks液将抗凝血稀释1倍;吸取人淋巴细胞分离液置于刻度离心管中,加入稀释的全血; 2000 r/min离心20min;吸取所有单个核细胞,用Hanks液洗涤细胞3次。将单个核细胞离心收集备用。
1.4 单个核细胞总RNA的制备、RTPCR及克隆入载体pcDNA3.1(+)
将离心收集的单个核细胞1×105加入Trizol 1 mL,混匀,室温5 min;加0.2 mL氯仿,涡旋15 s, 4℃12 000g,离心10 min,吸取上清液至另一1.5 mL Eppendorf管,加入等体积预冷的异丙醇,放置10 min,4℃12 000g,离心10 min,去上清液,加入1 mL预冷的浓度为750 mL/L乙醇,充分混匀振荡,4℃12 000g,离心10min,去上清液,充分干燥,用50μL含1 mL/L DEPC的ddH2O溶解沉淀,获得细胞总RNA。取5μL总RNA,按RTPCR试剂盒推荐方法以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链。取2μl逆转录产物为模板,加入10 mM dNTP 1. 5 ml,10′PCR缓冲液5m,l 50mMMgSO41m,l两引物各10pmo,l补水至50m,l PCR反应条件为: 95℃预变性5 min,94℃变性15s,55℃退火30s,72℃延伸1 min,反应30个循环后,72℃延伸10 min。取PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析。按照Wizard PCR产物纯化试剂盒说明书纯化,回收PCR产物,经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,定向插入表达载体pcDNA3.1(+)的相应位点。该质粒命名为pGal9,经PCR、HindⅢ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定序列的正确性。
1.5 统计学方法
采用Prism4.0软件行单因素方差分析,以及组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Gal9的RTPCR扩增
从单个核细胞中提取细胞总RNA,以此为模板,应用前述引物进行RTPCR,将扩增产物于10 g/L琼脂糖电泳中,可见分布于Marker 1.0~1.5 kb的特异条带,与预计长度1176 bp相符(图1)。
2.2 真核质粒pGal9构建和鉴定
将RTPCR扩增产物,经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后,克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)。阳性克隆送英骏公司测序,同时进一步对阳性重组质粒进行PCR和双酶切鉴定。以阳性重组质粒为模板,用前述特异性引物进行PCR,可扩增出与预计长度1176 bp相符的目的片段,而空载体则为阴性结果(图2A)。阳性重组质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后电泳,同样可见与预计长度相符的片段(图2B)。测序结果表明,PCR扩增获得并克隆的Gal9片段序列与GenBank中的序列完全一致(结果未附)。1 Marker;2 RTPCR product of Gal9 gene图1 RTPCR扩增Gal9基因CDS序列A PCR analysis:1 Marker;2 PCR product of pGal9;3 PCR product of pcDNA3.1(+);B Double restriction enzyme digestion analysis:1 Marker;2 pcDNA3.1(+)dynamitin digested with HindⅢ and EcoRⅠ;3 pGal9dynamitin digested with HindⅢ and EcoRⅠ。 图2 真核表达质粒pGal9的PCR和双酶切鉴定
  3 讨论
半乳糖凝集素家族(galectin family)是含有一个保守糖识别域的β半乳糖苷结合凝集素。半乳糖凝集素家族有15名成员,广泛参与许多生理和病理过程,包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等[1,2]。β半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白,属于alectin家族成员,组织分布广泛,具有多种生物学活性,参与细胞聚集和粘附、增殖、死亡和调节炎症及免疫反应等多种生理和病理过程[3]。为进一步研究Gal9的作用机制,我们通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Gal9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了包含Gal9基因的真核表达载体pGal9。为鉴定真核表达载体pGal9,以阳性重组质粒为模板,用前述特异性引物进行PCR,证明获得的真核表达载体pGal9可扩增出与预计长度1176 bp相符的目的片段,而空载体则未见PCR扩增产物。获得的真核表达载体pGal9经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后电泳,同样可见与预计长度相符的片段。测序结果证明,PCR扩增获得并克隆的Gal9片段序列与GenBank中的序列完全一致。通过上述实验可以证明我们成功构建并获得了包含Gal9目的基因的真核表达载体pGal9。
在Gal9当初被发现时,引人注意的是ECA活性[4],然而随着研究的不断深入,Gal9越来越多的生物学功能被人们所了解,这使得人们对Gal9乃至整个galectin家族的兴趣日益浓厚。研究发现,Gal9通过诱导Th1细胞凋亡,抑制Th17细胞的产生,增加调节性T细胞的生成,来改善小鼠自身免疫性疾病模型的严重性,如实验性脑脊髓炎(EAE)[5]和胶原性关节炎(CIA)[6]。相信今后的免疫学研究方向不仅关注于galectin家族的其他成员,还将对Gal9发挥作用的具体机制,尤其是对免疫系统的影响作进一步深入探讨,从而使Gal9作为免疫病理性疾病治疗的新的靶点成为可能。
综上所述,我们成功克隆了能够正确表达Gal9目的基因的真核表达载体pGal9,为进一步研究的Gal9功能提供方便,并为进一步探讨Gal9对免疫系统的影响奠定了基础。
【参考文献】
 1Elola MT, WolfensteinTodel C, Troncoso MF, Vasta GR, Rabinovich GA. Galectins: matricellular glycanbinding proteins linking cell adhesion, migration, and survival. Cell Mol Life Sci, 2007,64:1679~700.
2 Hasan SS, Ashraf GM, Banu N. Galectinspotential targets for cancer therapy. Cancer Lett, 2007,253:25~33.
3 Hirashima M, Kashio Y, Nishi N, et al. Galectin9 in physiological and pathological conditions. Glycoconj J, 2004,19: 593~600.
4 Mitsuomi Hirashima, Yumiko Kashio, Nozomu Nishi,et al. Galectin9 in physiological and pathological Conditions. Glycoconjugate, 2004,19: 593~600.
5 Anderson AC, Anderson DE, Bregoli L, et al. Promotion of tissue inflammation by the immune receptor Tim3 expressed on innate immune cells. Science, 2007, 318: 1141~1143.
6 Seki M, Oomizu S, Sakata KM, et al. Galectin9 suppresses the generation of Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis. Clin Immunol, 2008,127(1): 78~88.

 
 
 
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