| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-19页 |
| 第一章 绪论 | 第19-43页 |
| 1 脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)的研究进展 | 第19-25页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌的分离 | 第19-22页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌的命名和分类 | 第22-23页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌的鉴定 | 第23-25页 |
| ·形态学鉴定 | 第23页 |
| ·细胞膜脂肪酸组分分析 | 第23页 |
| ·甲基萘醌分析 | 第23页 |
| ·16S rRNA分析 | 第23-24页 |
| ·生理生化鉴定 | 第24-25页 |
| ·生长条件试验 | 第25页 |
| 2 脂环酸芽孢杆菌的防控技术 | 第25-28页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌属快速检测方法 | 第25-26页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌属的防控技术研究 | 第26-28页 |
| 3 木聚糖酶 | 第28-31页 |
| ·木聚糖酶的理化性质 | 第28-29页 |
| ·木聚糖酶的分类 | 第29页 |
| ·木聚糖酶的应用 | 第29-31页 |
| ·木聚糖酶在造纸工业中的应用 | 第29-30页 |
| ·木聚糖酶在饲料工业中的应用 | 第30页 |
| ·木聚糖酶在酿造工业中的应用 | 第30页 |
| ·木聚糖酶在其他方面的应用 | 第30-31页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌属木聚糖酶的研究进展 | 第31页 |
| 4 β-葡聚糖酶 | 第31-33页 |
| ·β-葡聚糖酶的研究进展 | 第31-32页 |
| ·β-葡聚糖酶的应用 | 第32页 |
| ·β-葡聚糖酶在啤酒生产中的应用 | 第32页 |
| ·β-葡聚糖酶在饲料生产中的应用 | 第32页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌属β-葡聚糖酶的研究进展 | 第32-33页 |
| 5 α-淀粉酶(α-amylase) | 第33-37页 |
| ·α-淀粉酶的种类 | 第34页 |
| ·α-淀粉酶的分子结构 | 第34页 |
| ·α-淀粉酶的应用与展望 | 第34-35页 |
| ·α-淀粉酶在面包焙烤中的应用 | 第34-35页 |
| ·淀粉的液化和糖化作用 | 第35页 |
| ·纤维脱浆 | 第35页 |
| ·造纸工业 | 第35页 |
| ·α-淀粉酶在洗涤行业中的应用 | 第35页 |
| ·双酶法制糖工艺 | 第35-36页 |
| ·淀粉的糊化 | 第36页 |
| ·液化 | 第36页 |
| ·糖化 | 第36页 |
| ·现状 | 第36-37页 |
| 6 脂环酸芽孢杆菌属基因组测序进展 | 第37-38页 |
| ·核酸测序技术的进展 | 第37页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌属基因组测序进展 | 第37-38页 |
| 7 分子克隆研究技术概述 | 第38页 |
| ·Tail-PCR技术 | 第38页 |
| ·简并PCR引物设计(Degenerate PCR) | 第38页 |
| 8 外源表达系统的介绍 | 第38-42页 |
| ·大肠杆菌表达系统概述 | 第38-39页 |
| ·对表达载体的优化 | 第39页 |
| ·对宿主细胞的改造 | 第39页 |
| ·提高mRNA的稳定性 | 第39页 |
| ·发酵条件 | 第39页 |
| ·毕赤酵母表达系统概述 | 第39-42页 |
| ·外源蛋白自身的影响 | 第40页 |
| ·启动子的选择 | 第40页 |
| ·信号肽的选择 | 第40-41页 |
| ·转录后翻译水平 | 第41页 |
| ·培养条件的影响 | 第41页 |
| ·阻止外源蛋白降解 | 第41-42页 |
| 9 研究目的与意义 | 第42-43页 |
| 第二章 脂环酸芽孢杆菌的筛选与产酶分析 | 第43-51页 |
| 1 实验材料 | 第43-44页 |
| ·土样、菌株和质粒 | 第43页 |
| ·引物合成和核酸序列测序 | 第43页 |
| ·试剂盒、工具酶与生化试剂 | 第43页 |
| ·仪器 | 第43页 |
| ·培养基 | 第43页 |
| ·常用溶液 | 第43-44页 |
| 2 实验方法 | 第44-45页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌的筛选及分离 | 第44页 |
| ·菌株的鉴定 | 第44-45页 |
| ·菌落形态及生长条件的测定 | 第44页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第44页 |
| ·16S rDNA的PCR扩增 | 第44-45页 |
| ·DNA凝胶回收 | 第45页 |
| ·DNA片段的连接、转化 | 第45页 |
| ·重组子的筛选 | 第45页 |
| ·产酶分析 | 第45页 |
| ·产酶培养 | 第45页 |
| ·酶活力测定 | 第45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-48页 |
| ·菌株的鉴定 | 第45-47页 |
| ·菌株的16S rDNA鉴定结果 | 第45-47页 |
| ·菌落形态及孢子形态观察 | 第47页 |
| ·菌株在不同温度及pH下的生长情况 | 第47页 |
| ·菌株A4 和A15 产酶分析 | 第47-48页 |
| 4 讨论 | 第48-50页 |
| 本章小结 | 第50-51页 |
| 第三章 Alicyclobacillus sp.A4 酸性淀粉酶的分离纯化及其酶学性质研究 | 第51-61页 |
| 1 实验材料 | 第51页 |
| ·菌株 | 第51页 |
| ·生化试剂 | 第51页 |
| ·仪器 | 第51页 |
| ·培养基 | 第51页 |
| 2 实验方法 | 第51-54页 |
| ·α-淀粉酶(AmyA4)粗酶液的获得 | 第51页 |
| ·原酶AmyA4 的纯化 | 第51-52页 |
| ·淀粉酶活性测定 | 第52页 |
| ·分子量的测定 | 第52页 |
| ·纯化蛋白的质谱鉴定与内肽序列的测定 | 第52页 |
| ·淀粉水分测定 | 第52页 |
| ·淀粉的转化率 | 第52页 |
| ·酶学性质 | 第52-53页 |
| ·最适pH和pH稳定性 | 第52-53页 |
| ·最适温度及热稳定性 | 第53页 |
| ·不同金属离子及相关化学试剂对淀粉酶的影响 | 第53页 |
| ·不同来源生淀粉的水解实验 | 第53页 |
| ·不同浓度土豆生淀粉水解实验 | 第53页 |
| ·双酶法制糖工艺研究 | 第53-54页 |
| ·土豆淀粉液化 | 第53页 |
| ·土豆淀粉糖化 | 第53页 |
| ·双酶法制糖工艺 | 第53-54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-58页 |
| ·来源于脂环酸芽孢杆菌的酸性淀粉酶AmyA4 的纯化 | 第54-55页 |
| ·淀粉酶的内肽质谱鉴定 | 第55页 |
| ·淀粉酶的酶学性质 | 第55-58页 |
| ·淀粉酶AmyA4 的最适作用pH及pH稳定性和最适作用温度及热稳定性 | 第55-56页 |
| ·金属离子及其它化学试剂对淀粉酶AmyA4 活性的影响 | 第56-57页 |
| ·不同来源生淀粉的水解实验 | 第57页 |
| ·不同浓度土豆生淀粉水解实验 | 第57页 |
| ·双酶法制糖工艺 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 本章小结 | 第60-61页 |
| 第四章 Alicyclobacillus sp.A4 酸性葡聚糖酶的纯化和基因克隆研究 | 第61-83页 |
| 1 实验材料 | 第61页 |
| ·菌株 | 第61页 |
| ·生化试剂 | 第61页 |
| ·仪器 | 第61页 |
| ·培养基 | 第61页 |
| 2 实验方法 | 第61-69页 |
| ·原酶CelA4 粗酶液的获得 | 第61页 |
| ·原酶CelA4 的纯化 | 第61-62页 |
| ·分子量的测定 | 第62页 |
| ·葡聚糖酶转PVDF膜 | 第62页 |
| ·纯化蛋白的质谱鉴定与内肽序列的测定 | 第62页 |
| ·葡聚糖酶基因CelA4 的基因序列获得与分析 | 第62页 |
| ·葡聚糖酶基因成熟蛋白CelA4F和截短蛋白CelA4T的基因序列的克隆 | 第62-63页 |
| ·酶切与连接 | 第63-64页 |
| ·葡聚糖酶基因CelA4F和CelA4T在毕赤酵母中的表达 | 第64-65页 |
| ·重组表达载体的线性化 | 第64页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第64-65页 |
| ·电转化 | 第65页 |
| ·摇瓶中目的基因在毕赤酵母中的表达 | 第65页 |
| ·发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵 | 第65页 |
| ·重组酶CelA4 的分离纯化及鉴定 | 第65-66页 |
| ·重组酶的脱糖基化实验 | 第66页 |
| ·酶学性质 | 第66-69页 |
| ·酶活单位定义 | 第66页 |
| ·葡萄糖标准曲线的制定 | 第66-67页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第67页 |
| ·葡聚糖酶K_m值和V_(max)的测定 | 第67-68页 |
| ·葡聚糖酶的最适pH和pH稳定性的测定 | 第68页 |
| ·葡聚糖酶的反应最适温度及热稳定性的测定 | 第68页 |
| ·不同金属离子及相关化学试剂对葡聚糖酶的影响 | 第68页 |
| ·葡聚糖酶比活性测定 | 第68页 |
| ·底物特异性的测定 | 第68页 |
| ·抗蛋白酶能力测定 | 第68-69页 |
| ·葡聚糖酶在人工胃液中稳定性的测定 | 第69页 |
| ·葡聚糖酶在人工胃液中对大麦葡聚糖中还原糖的水解能力的测定 | 第69页 |
| ·葡聚糖酶在人工胃液中对大麦豆粕型日粮粘度的影响 | 第69页 |
| ·粘度的测定 | 第69页 |
| 3 结果与分析 | 第69-78页 |
| ·来源于脂环酸芽孢杆菌的葡聚糖酶CelA4 的纯化 | 第69-70页 |
| ·葡聚糖酶的N端测序和内肽质谱鉴定 | 第70-71页 |
| ·葡聚糖酶的基因序列分析 | 第71-74页 |
| ·重组酶CelA4F和CelA4T在毕赤酵母中的表达 | 第74-75页 |
| ·具有葡聚糖酶活性的转化子的筛选 | 第74页 |
| ·发酵罐水平表达CelA4F和CelA4T | 第74-75页 |
| ·重组酶CelA4F和CelA4T的分离纯化及鉴定 | 第75页 |
| ·葡聚糖酶的酶学性质 | 第75-78页 |
| ·葡聚糖酶CelA4 的pH及温度适用性和稳定性 | 第75-76页 |
| ·金属离子及其它化学试剂对葡聚糖酶CelA4 活性的影响 | 第76-77页 |
| ·葡聚糖酶CelA4 的反应动力学 | 第77页 |
| ·葡聚糖酶CelA4 的底物特异性 | 第77页 |
| ·葡聚糖酶CelA4 的抗蛋白酶能力测定 | 第77-78页 |
| ·葡聚糖酶CelA4 在人工胃液中的稳定性 | 第78页 |
| ·葡聚糖酶CelA4 在人工胃液中水解大麦葡聚糖能力 | 第78页 |
| 4 讨论 | 第78-82页 |
| 本章小结 | 第82-83页 |
| 第五章 Alicyclobacillus sp.A4 第九家族葡聚糖酶的克隆，表达及性质分析 | 第83-96页 |
| 1 实验材料 | 第83页 |
| ·菌株和质粒 | 第83页 |
| ·引物合成 | 第83页 |
| ·试剂盒、工具酶和生化试剂 | 第83页 |
| ·仪器 | 第83页 |
| ·培养基 | 第83页 |
| ·常用溶液 | 第83页 |
| 2 实验方法 | 第83-87页 |
| ·葡聚糖酶基因Agl9A序列的获得 | 第83-84页 |
| ·葡聚糖酶基因Agl9A序列的克隆 | 第84页 |
| ·酶切与连接 | 第84页 |
| ·重组表达载体的线性化 | 第84页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第84页 |
| ·电转化 | 第84页 |
| ·目的基因在毕赤酵母中摇瓶水平的表达 | 第84-85页 |
| ·重组酶Agl9A的分离纯化及性质测定 | 第85-87页 |
| ·酶活单位定义 | 第85页 |
| ·葡萄糖标准曲线的制定 | 第85页 |
| ·蛋白含量测定 | 第85页 |
| ·变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第85页 |
| ·发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵 | 第85页 |
| ·重组酶Agl9A的分离纯化 | 第85页 |
| ·重组酶Agl9A酶反应最适pH及pH稳定性测定 | 第85页 |
| ·重组酶Agl9A酶反应最适温度及热稳定性测定 | 第85页 |
| ·不同金属离子及相关化学试剂对重组酶Agl9A酶活影响的测定 | 第85页 |
| ·重组酶Agl9A对Ca~(2+)依赖性的测定 | 第85-86页 |
| ·重组酶Agl9A抗蛋白酶能力测定 | 第86页 |
| ·重组酶Agl9A比活的测定 | 第86页 |
| ·重组酶Agl9A的 Km和Vmax值的测定 | 第86页 |
| ·重组酶Agl9A对麦芽汁的水解实验 | 第86页 |
| ·过滤速率和粘度的测定 | 第86-87页 |
| 3 结果与分析 | 第87-95页 |
| ·Agl9A基因序列的获得与分析 | 第87页 |
| ·重组酶Agl9A的纯化 | 第87页 |
| ·重组酶Agl9A的酶学性质研究 | 第87-93页 |
| ·pH与温度对重组酶Agl9A酶反应的影响 | 第87页 |
| ·不同金属离子及相关化学试剂对重组酶Agl9A酶活的影响 | 第87页 |
| ·重组酶Agl9A对Ca~(2+)依赖性的测定 | 第87-91页 |
| ·重组酶Agl9A抗蛋白酶能力测定 | 第91-92页 |
| ·重组酶Agl9A的K_m值和V_(max)测定 | 第92-93页 |
| ·重组酶Agl9A降低麦芽汁过滤速率和粘度的测定 | 第93页 |
| 4 讨论 | 第93-95页 |
| 本章小结 | 第95-96页 |
| 第六章 Alicyclobacillus sp.A4 的木聚糖酶基因的克隆，表达及性质分析 | 第96-107页 |
| 1 实验材料 | 第96页 |
| ·菌株和质粒 | 第96页 |
| ·生化试剂 | 第96页 |
| ·仪器 | 第96页 |
| ·培养基 | 第96页 |
| ·常用溶液 | 第96页 |
| 2 实验方法 | 第96-100页 |
| ·原核表达载体pET-226(+)-XynA4 的构建 | 第96-99页 |
| ·木聚糖酶基因XynA4 的克隆 | 第96-97页 |
| ·DNA片段的回收和连接 | 第97页 |
| ·两步Tail-PCR方法获得基因XynA4 上下游序列 | 第97-98页 |
| ·pET-226(+)-XynA4 表达载体的构建 | 第98-99页 |
| ·酶切与连接 | 第99页 |
| ·重组质粒pET-226(+)-XynA4 转化大肠杆菌BL21(DE3) | 第99页 |
| ·重组酶XynA4 在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达 | 第99页 |
| ·重组酶XynA4 的分离纯化及性质测定 | 第99-100页 |
| ·酶活单位定义 | 第99页 |
| ·木糖标准曲线的制定 | 第99页 |
| ·蛋白含量测定 | 第99-100页 |
| ·变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第100页 |
| ·重组酶XynA4 的分离纯化 | 第100页 |
| ·最适pH及pH稳定性 | 第100页 |
| ·最适温度及热稳定性 | 第100页 |
| ·金属离子和相关化学试剂的影响 | 第100页 |
| ·重组酶XynA4 比活的测定 | 第100页 |
| 3 结果与分析 | 第100-104页 |
| ·XynA4 基因的克隆与序列分析 | 第100-101页 |
| ·重组酶XynA4 在大肠杆菌中的表达 | 第101-102页 |
| ·重组酶XynA4 的纯化 | 第102-103页 |
| ·重组酶XynA4 的酶学性质研究 | 第103-104页 |
| ·pH与温度对重组酶XynA4 酶活的影响 | 第103页 |
| ·金属离子及化学试剂对XynA4 酶活的影响 | 第103-104页 |
| ·重组酶XynA4 的K_m值和V_(max) | 第104页 |
| 4 讨论 | 第104-106页 |
| 本章小结 | 第106-107页 |
| 第七章 Alicyclobacillus sp.A4 全基因组序列初步分析 | 第107-124页 |
| 1 实验材料 | 第107页 |
| ·菌株 | 第107页 |
| ·培养基 | 第107页 |
| 2 实验方法 | 第107-108页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌A4 基因组DNA的提取 | 第107页 |
| ·脂环酸芽孢杆菌A4 全基因组测序 | 第107页 |
| ·基因组以及质粒ORF的预测和注释 | 第107-108页 |
| ·代谢途径 | 第108页 |
| 3 结果 | 第108-121页 |
| ·菌株Alicyclobacillus sp.A4 的总基因组提取 | 第108页 |
| ·测序与组装 | 第108-109页 |
| ·染色体基因组序列的基本特征 | 第109页 |
| ·染色体基因组序列的代谢调控 | 第109-112页 |
| ·质粒基因组序列的基本特征 | 第112-114页 |
| ·质粒基因组序列的代谢调控图 | 第114-115页 |
| ·Alicyclobacillus sp.A4 全基因组共线性分析 | 第115页 |
| ·Alicyclobacillus sp.A4 分泌组蛋白分析 | 第115-120页 |
| ·Alicyclobacillus sp.A4 糖基水解酶分析 | 第120-121页 |
| 4 讨论 | 第121-123页 |
| 本章小结 | 第123-124页 |
| 第八章 结论 | 第124-126页 |
| 参考文献 | 第126-139页 |
| 致谢 | 第139-140页 |
| 作者简历 | 第140页 |
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