| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 上篇 文献综述 | 第12-35页 |
| 第一章 CRISPR/Cas系统的研究进展 | 第13-28页 |
| 1 CRISPR/Cas系统的概述 | 第13-22页 |
| 1.1 CRISPR/Cas系统的发展过程 | 第13-14页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统的作用原理 | 第14-20页 |
| 1.2.1 spacer的获取 | 第17-19页 |
| 1.2.2 pre-crRNA的转录与加工 | 第19页 |
| 1.2.3 CRISPR系统对入侵核酸的切割 | 第19-20页 |
| 1.3 CRISPR/Cas系统的分类 | 第20-22页 |
| 1.3.1 Type Ⅰ型CRISPR/Cas系统 | 第20-21页 |
| 1.3.2 Type Ⅱ型CRISPR/Cas系统 | 第21页 |
| 1.3.3 Type Ⅲ型CRISPR/Cas系统 | 第21-22页 |
| 2 CRISPR/Cas9系统的应用 | 第22-28页 |
| 2.1 CRISPR/Cas9系统用于基因组编辑 | 第22-25页 |
| 2.1.1 CRISPR/Cas9系统在大豆疫霉中的建立 | 第23-24页 |
| 2.1.2 CRISPR/Cas9系统对大豆疫霉内源基因的编辑 | 第24-25页 |
| 2.2 CRISPR/Cas9系统的脱靶效应 | 第25-26页 |
| 2.3 CRISPR/Cas9系统的应用情况 | 第26-28页 |
| 参考文献 | 第28-35页 |
| 下篇 研究内容 | 第35-75页 |
| 第一章 利用CRISPR/Cas9敲除系统分析PsMAS1的生物学功能 | 第37-63页 |
| 1 材料与方法 | 第38-48页 |
| 1.1 供试菌株 | 第38页 |
| 1.2 培养基的制备 | 第38-39页 |
| 1.3 载体的构建 | 第39-41页 |
| 1.3.1 hSPCas9表达载体 | 第39页 |
| 1.3.2 sgRNA载体构建 | 第39-41页 |
| 1.4 大豆疫霉转化 | 第41-42页 |
| 1.4.1 大豆疫霉生长 | 第41页 |
| 1.4.2 制备原生质体 | 第41-42页 |
| 1.4.3 原生质体转化 | 第42页 |
| 1.5 转化子的筛选 | 第42-44页 |
| 1.5.1 提取转化子基因组DNA | 第42-43页 |
| 1.5.2 通过PCR和基因组测序来验证目的基因的敲除 | 第43-44页 |
| 1.6 大豆疫霉菌株的培养和无性发育各阶段菌体的获得 | 第44页 |
| 1.7 PsMAD1敲除突变体的表型分析 | 第44-45页 |
| 1.8 外源添加糖类物质刺激P6497大量孢子囊直接萌发 | 第45页 |
| 1.9 提取RNA和RNA逆转录 | 第45-46页 |
| 1.9.1 RNA的提取 | 第45页 |
| 1.9.2 RNA逆转录 | 第45-46页 |
| 1.10 致病性测定 | 第46-47页 |
| 1.11 SYBR Green实时定量PCR分析 | 第47-48页 |
| 1.12 大豆疫霉对非生物胁迫的耐受性测定 | 第48页 |
| 2 结果与分析 | 第48-57页 |
| 2.1 PsMAD1基因中sgRNA序列的筛选分析 | 第48-49页 |
| 2.2 PsMAD1基因sgRNA载体的构建 | 第49页 |
| 2.3 PsMAD1敲除突变体的获得 | 第49-50页 |
| 2.4 PsMAD1敲除突变体的表型分析 | 第50-57页 |
| 2.4.1 PsMAD1的敲除不影响大豆疫霉的生长及菌落形态 | 第50-51页 |
| 2.4.2 PsMAD1调控大豆疫霉游动孢子的释放 | 第51-52页 |
| 2.4.3 PsMAD1是孢子囊割裂期重要的调控因子 | 第52-54页 |
| 2.4.4 PsMAD1基因参与调控大豆疫霉的致病力 | 第54-57页 |
| 2.4.5 PsMAD1突变体不影响抗H_2O_2/osmotic/salt胁迫的能力 | 第57页 |
| 3 讨论 | 第57-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9敲除系统分析PsAvh238的生物学功能 | 第63-75页 |
| 1 材料与方法 | 第64-66页 |
| 1.1 供试菌株及植物材料 | 第64页 |
| 1.2 培养基的制备 | 第64-65页 |
| 1.3 大豆疫霉侵染不同组织的RNA的获得 | 第65页 |
| 1.4 载体的构建 | 第65页 |
| 1.5 大豆疫霉转化 | 第65页 |
| 1.6 转化子的筛选 | 第65-66页 |
| 1.6.1 荧光筛选转化子 | 第65页 |
| 1.6.2 CTAB法粗提荧光转化子基因组DNA | 第65页 |
| 1.6.3 通过PCR和基因测序的方法来验证目的基因的敲除 | 第65页 |
| 1.6.4 试剂盒精提基因组DNA | 第65-66页 |
| 1.6.5 通过连T载体和基因测序的方法来进一步验证目的基因的敲除 | 第66页 |
| 1.7 生长速率测定 | 第66页 |
| 1.8 致病性测定 | 第66页 |
| 2 结果与分析 | 第66-71页 |
| 2.1 PsAvh238在侵染大豆的过程中受PsMAD1转录因子的调控 | 第66-68页 |
| 2.2 PsAvh238基因中sgRNA序列的筛选分析 | 第68页 |
| 2.3 PsAvh238基因sgRNA载体的构建 | 第68-69页 |
| 2.4 PsAvh238敲除突变体的获得 | 第69-70页 |
| 2.5 PsAvh238的敲除不影响大豆疫霉的生长及菌落形态 | 第70页 |
| 2.6 PsAvh238基因参与调控大豆疫霉的致病力 | 第70-71页 |
| 3 讨论 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-75页 |
| 附录 | 第75-91页 |
| 附录一 利用CRISPR/Cas9敲除系统分析Ps144427的生物学功能 | 第75-87页 |
| 1 材料与方法 | 第76-77页 |
| 1.1 供试菌株及植物材料 | 第76页 |
| 1.2 培养基的制备 | 第76页 |
| 1.3 载体的构建 | 第76-77页 |
| 1.4 大豆疫霉转化 | 第77页 |
| 1.5 转化子的筛选 | 第77页 |
| 1.6 生长速率测定 | 第77页 |
| 1.7 致病性测定 | 第77页 |
| 2 结果与分析 | 第77-83页 |
| 2.1 在侵染大豆不同组织时Ps144427表达有差异 | 第77-78页 |
| 2.2 Ps144427基因中sgRNA序列的筛选分析 | 第78-79页 |
| 2.3 Ps144427基因sgRNA载体的构建 | 第79页 |
| 2.4 Ps144427敲除突变体的获得 | 第79-80页 |
| 2.5 Ps144427的敲除不影响大豆疫霉的生长及菌落形态 | 第80-83页 |
| 2.6 Ps144427基因敲除不影响致病力 | 第83页 |
| 3 讨论 | 第83-85页 |
| 参考文献 | 第85-87页 |
| 附录二 | 第87-91页 |
| 本论文创新点 | 第91-93页 |
| 攻读硕士学位期间发表的研究论文 | 第93-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
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