1 前言 | 第1-40页 |
·香蕉的特性及经济意义 | 第14页 |
·香蕉果实采后生理学研究进展 | 第14-15页 |
·香蕉果实分子生物学研究进展 | 第15-22页 |
·分离香蕉采后果实乙烯生物合成相关的基因 | 第16页 |
·采用差异筛选方法分离果实成熟相关基因 | 第16-18页 |
·采用分离蛋白质方法克隆果实成熟相关基因 | 第18-19页 |
·其它重要果实成熟相关基因的分离与表达研究 | 第19-20页 |
·淀粉酶生理及分子生物学研究进展 | 第20-22页 |
·基因芯片(gene chip)技术 | 第22-25页 |
·基因芯片原理 | 第22页 |
·基因芯片分类 | 第22-23页 |
·芯片在植物功能基因组学研究中的应用 | 第23-25页 |
·利用芯片技术研究植物基因的结构 | 第23页 |
·利用芯片技术研究基因表达与发育生物学 | 第23页 |
·利用芯片技术研究基因的表达水平,建立基因表达谱 | 第23-24页 |
·利用基因芯片技术筛选抗性基因 | 第24页 |
·利用基因芯片技术研究基因突变及多态性分析 | 第24-25页 |
·利用芯片技术鉴定重要的目的基因 | 第25页 |
·抑制差减杂交技术 | 第25-29页 |
·SSH技术路线 | 第26-27页 |
·SSH的特点 | 第27-28页 |
·SSH在植物功能基因组学研究上的应用 | 第28-29页 |
·植物启动子研究进展 | 第29-37页 |
·高等植物启动子的结构 | 第29-30页 |
·转录起始位点 | 第29页 |
·TATA盒、CAAT盒与GC结构 | 第29-30页 |
·增强子和沉默子 | 第30页 |
·启动子的类型 | 第30-35页 |
·组成型启动子 | 第30-31页 |
·组织特异性启动子 | 第31-32页 |
·诱导型启动子 | 第32-35页 |
·香蕉启动子分离及应用概况 | 第35-37页 |
·本论文研究的目的意义 | 第37-40页 |
2 微阵列筛选香蕉果实特异表达cDNA片段 | 第40-50页 |
·材料与试剂 | 第40页 |
·植物材料 | 第40页 |
·试剂 | 第40页 |
·质粒及菌种 | 第40页 |
·抑制缩减文库构建 | 第40页 |
·微阵列制作方法 | 第40-44页 |
·SSH文库阳性质粒提取 | 第40-41页 |
·SSH文库中重组克隆的鉴定 | 第41页 |
·cDNA芯片制备 | 第41-42页 |
·将鉴定出的重组质粒的插入片段进行PCR扩增 | 第41页 |
·扩增的PCR产物纯化 | 第41页 |
·点样 | 第41-42页 |
·对样品的RNA进行标记 | 第42-44页 |
·香蕉果实和根、茎叶的总RNA的提取 | 第42-43页 |
·对样品的RNA进行标记 | 第43-44页 |
·杂交与清洗 | 第44页 |
·芯片扫描 | 第44页 |
·芯片图像的采集与数据分析 | 第44页 |
·芯片图像的采集与数据分析 | 第44页 |
·结果 | 第44-48页 |
·对阳性重组质粒进行PCR扩增 | 第44页 |
·芯片分析结果 | 第44-46页 |
·cDNA序列测定与BLAST分析 | 第46-48页 |
·cDNA的功能分类 | 第48页 |
·讨论 | 第48-50页 |
·关于确定光吸收值的比例问题 | 第48页 |
·关于未知功能和一些同源性比较低的cDNA片段 | 第48-49页 |
·不同实验方法对分离低丰度基因的影响 | 第49-50页 |
3 果实特异表达基因cDNA Northern blot分析 | 第50-53页 |
·材料与试剂 | 第50页 |
·方法 | 第50-52页 |
·RNA提取 | 第50页 |
·杂交探针标记 | 第50页 |
·随机挑选cDNA克隆 | 第50页 |
·标记反应 | 第50页 |
·杂交 | 第50-52页 |
·转膜 | 第50-51页 |
·Northern杂交 | 第51-52页 |
·结果与讨论 | 第52-53页 |
·cDNA表达的器官特异性 | 第52页 |
·cDNA表达量的差异 | 第52页 |
·Northern blot分析和芯片分析结果的一致性 | 第52-53页 |
4 香蕉果实a-1,4葡聚糖磷酸化酶基因克隆 | 第53-64页 |
·材料与试剂 | 第53页 |
·方法 | 第53-58页 |
·香蕉果实RNA提取 | 第53页 |
·香蕉果实第一链cDNA合成 | 第53-54页 |
·RACE引物设计 | 第54页 |
·RACE扩增BR63的5′端和3′端 | 第54-55页 |
·Master Mix的准备(CLOTECH's Advantage 2 Polymerase Mix) | 第54页 |
·5′RACE反应体系 | 第54-55页 |
·3′RACE反应体系 | 第55页 |
·PCR程序 | 第55页 |
·RACE产物的克隆及重组子筛选 | 第55-58页 |
·回收5′、3′RACE特异性条带 | 第55-56页 |
·回收PCR产物连接 | 第56页 |
·连接产物转化E.coli DH5α | 第56-57页 |
·重组质粒DNA的微量提取 | 第57页 |
·质粒DNA的大量提取 | 第57-58页 |
·重组质粒酶切鉴定及测序 | 第58页 |
·结果与讨论 | 第58-64页 |
·基因克隆及测序 | 第58-60页 |
·BR63片段5′、3′RACE扩增结果 | 第58-59页 |
·序列测定 | 第59-60页 |
·基因结构分析 | 第60-62页 |
·基因同源性比较 | 第62-63页 |
·利用RACE技术成功克隆到BR63的全长序列 | 第63页 |
·不同方法克隆3′RACE扩增比较 | 第63-64页 |
5 a-1,4葡聚糖磷酸化酶基因在香蕉果实成熟过程中的表达 | 第64-73页 |
·材料与试剂 | 第64页 |
·方法 | 第64-66页 |
·采后香蕉果实乙烯释放量及呼吸强度测定 | 第64-65页 |
·材料处理 | 第64-65页 |
·RT-PCR分析采后不同成熟阶段a-1,4葡聚糖磷酸化酶基因表达 | 第65-66页 |
·RNA提取 | 第65页 |
·cDNA第一连合成 | 第65页 |
·RT-PCR反应 | 第65-66页 |
·RT-PCR产物分析 | 第66页 |
·结果 | 第66-71页 |
·呼吸强度变化 | 第66页 |
·乙烯释放量的变化 | 第66页 |
·a-1,4葡聚糖磷酸化酶基因表达半定量PCR(RT-PCR)分析 | 第66-69页 |
·The Scion Image软件分析表达结果 | 第69-71页 |
·讨论 | 第71-73页 |
·a-1,4葡聚糖磷酸化酶基因表达量与香蕉果实采后呼吸、乙烯变化的关系 | 第71页 |
·a-1,4葡聚糖磷酸化酶基因在果实采后成熟过程中的表达 | 第71页 |
·关于基因表达的半定量方法 | 第71-73页 |
6 香蕉果实特异表达启动子克隆 | 第73-80页 |
·材料与试剂 | 第73页 |
·植物材料 | 第73页 |
·试剂 | 第73页 |
·质粒及菌种 | 第73页 |
·方法 | 第73-76页 |
·香蕉凝集素(Banana Lectin,BanLec)基因表达研究 | 第73页 |
·BanLec基因启动子的克隆 | 第73-76页 |
·香蕉基因组DNA提取 | 第73-74页 |
·香蕉基因组DNA酶切消化 | 第74页 |
·酶切产物纯化 | 第74页 |
·纯化后基因组DNA与GenomeWalker Adaptors连接 | 第74-75页 |
·以GenomeWalker Libraries为模板的PCR | 第75-76页 |
·PCR产物回收 | 第76页 |
·回收PCR产物连接和转化 | 第76页 |
·重组质粒酶切鉴定及测序 | 第76页 |
·结果 | 第76-79页 |
·DNA提取及内切酶消化 | 第76页 |
·启动子片断扩增及测序 | 第76-78页 |
·启动子序列分析 | 第78-79页 |
·讨论 | 第79-80页 |
·克隆到的启动子序列的长度 | 第79页 |
·启动子序列分析 | 第79-80页 |
7 凝集素基因启动子植物表达载体(pBIL2和pBIB2)的构建 | 第80-88页 |
·材料与试剂 | 第80页 |
·方法 | 第80-85页 |
·植物表达载体pBIL2构建 | 第80-82页 |
·BanLec基因启动子序列(命名为BL2)PCR扩增 | 第80-82页 |
·植物表达载体pBIB2构建 | 第82-85页 |
·芪合酶(命名为LAB)基因PCR扩增 | 第82-84页 |
·LAB PCR产物回收、测序 | 第84页 |
·LAB PCR回收产物及pBIL2表达载体BamH1、Sac1双酶切 | 第84页 |
·回收酶切目的基因及载体片段 | 第84页 |
·pBIB2载体连接 | 第84页 |
·pBIB2载体转化大肠杆菌DH5α | 第84页 |
·质粒DNA微量提取及重组子的酶切鉴定 | 第84-85页 |
·结果 | 第85-88页 |
·BanLec基因启动子植物表达载体pBIL2的构建 | 第85页 |
·芪合酶基因(LAB)克隆及测序 | 第85-86页 |
·Banlec基因启动子连接芪合酶基因(LAB)表达载体pBIB2构建 | 第86-88页 |
8 凝集素基因启动子瞬时表达活性检测 | 第88-94页 |
·材料与试剂 | 第88页 |
·设备 | 第88页 |
·方法 | 第88-91页 |
·香蕉转化材料的准备 | 第88页 |
·基因枪转化 | 第88-89页 |
·质粒PBI121、pBIL2的大量提取 | 第88页 |
·微弹制备(王关林等,2002) | 第88-89页 |
·基因枪轰击香蕉材料 | 第89页 |
·GUS组织化学染色 | 第89页 |
·GUS活性检测 | 第89-91页 |
·GUS提取液的制备 | 第89-90页 |
·GUS提取液蛋白含量测定 | 第90-91页 |
·酶反应 | 第91页 |
·结果与讨论 | 第91-94页 |
·pBIL2载体在香蕉不同组织中瞬时表达结果 | 第91页 |
·pBI121与pBIL2载体GUS活性检测 | 第91-94页 |
·GUS提取液蛋白含量 | 第91页 |
·转化24小时后一定时间内GUS酶活力变化 | 第91-94页 |
9 果实特异表达启动子启动芪合酶基因在番茄中的表达 | 第94-103页 |
·材料与试剂 | 第94页 |
·方法 | 第94-97页 |
·pBIB2质粒导入农杆菌GV3103 | 第94页 |
·PCR检测 | 第94-95页 |
·GV3103介导的番茄遗传转化 | 第95页 |
·转化番茄的鉴定 | 第95-97页 |
·PCR检测 | 第95-96页 |
·转化植株的Southern blot检测 | 第96-97页 |
·转基因番茄RT-PCR检测 | 第97页 |
·HPLC分析 | 第97页 |
·结果 | 第97-100页 |
·pBIB2转化番茄的出愈、分化、生根及大田种植 | 第97-98页 |
·pBIB2转化番茄PCR检测及Southern blot分析 | 第98-99页 |
·转基因植株RT-PCR检测 | 第99页 |
·转化番茄植株白藜芦醇含量的测定 | 第99-100页 |
·讨论 | 第100-103页 |
·果实作为生物反应器的研究 | 第100页 |
·白藜芦醇的生物学功能及转基因研究 | 第100-101页 |
·BanLec基因启动子启动芪合酶基因在番茄中表达 | 第101-102页 |
·构建含有葡萄芪合酶基因融合表达载体的意义 | 第102-103页 |
10 结论 | 第103-105页 |
参考文献 | 第105-117页 |
附录: | 第117-129页 |
致谢 | 第129页 |