论文创新点 | 第5-10页 |
摘要 | 第10-12页 |
ABSTRACT | 第12-14页 |
第1章 研究背景 | 第15-31页 |
1 天然免疫简介 | 第15页 |
2 天然免疫中的模式识别受体 | 第15-22页 |
2.1 Toll样受体 | 第16-19页 |
2.2 RIG-I样受体 | 第19-20页 |
2.3 NOD样受体 | 第20-21页 |
2.4 DNA受体 | 第21-22页 |
3 RLR介导的天然免疫反应 | 第22-26页 |
3.1 RLR家族成员的结构 | 第22-23页 |
3.2 RLR对病毒核酸的识别机制 | 第23页 |
3.3 RLR介导的信号转导通路 | 第23-26页 |
4 cGAS-MITA介导的天然免疫信号通路 | 第26-31页 |
4.1 cGAS和cGAMP的发现 | 第26-27页 |
4.2 cGAS的激活机制 | 第27-28页 |
4.3 cGAS-cGAMP-MITA信号通路 | 第28-29页 |
4.4 cGAS-cGAMP-MITA信号通路的调控 | 第29-31页 |
第2章 实验材料与实验方法 | 第31-47页 |
1 实验材料 | 第31-33页 |
1.1 细胞以及细胞培养 | 第31页 |
1.2 病毒、核酸模拟物以及细胞因子 | 第31-32页 |
1.3 实验相关试剂、抗体 | 第32页 |
1.4 实验相关的表达载体及其构建 | 第32-33页 |
1.5 实时荧光定量PCR相关试剂及材料 | 第33页 |
1.6 ELISA实验相关试剂 | 第33页 |
2 实验方法 | 第33-47页 |
2.1 真核及原核表达载体的构建 | 第33-34页 |
2.2 质粒提取 | 第34页 |
2.3 细胞培养 | 第34-35页 |
2.4 细胞转染 | 第35-36页 |
2.4.1 磷酸钙转染 | 第35页 |
2.4.2 脂质体转染 | 第35-36页 |
2.5 双荧光素酶报告基因实验 | 第36页 |
2.6 RT-PCR实验 | 第36-38页 |
2.6.1 mRNA的提取 | 第36页 |
2.6.2 逆转录 | 第36-37页 |
2.6.3 实时荧光定量PCR | 第37-38页 |
2.7 逆转录病毒感染构建shRNA稳定敲低细胞系 | 第38页 |
2.8 体细胞基因敲除 | 第38-39页 |
2.8.1 利用CRISPR-Cas9方法构建基因敲除的单克隆细胞 | 第38-39页 |
2.8.2 利用CRISPR-Cas9方法构建基因敲除的稳定细胞系 | 第39页 |
2.9 免疫共沉淀以及免疫印迹实验 | 第39-40页 |
2.9.1 免疫共沉淀实验 | 第39-40页 |
2.9.2 免疫印迹实验 | 第40页 |
2.10 泛素化实验 | 第40-41页 |
2.11 体外RNA/DNA pull-down实验 | 第41-42页 |
2.11.1 体外RNA pull-down实验 | 第41页 |
2.11.2 体外DNA pull-down实验 | 第41-42页 |
2.12 半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳(SDD-AGE) | 第42页 |
2.13 激光共聚焦显微镜观察实验以及邻位连接技术(PLA) | 第42-43页 |
2.14 制备小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞的方法 | 第43页 |
2.15 制备小鼠肺成纤维细胞和胚胎成纤维细胞的方法 | 第43-44页 |
2.15.1 肺成纤维细胞的制备 | 第43-44页 |
2.15.2 胚胎成纤维细胞的制备 | 第44页 |
2.16 ELISA实验 | 第44-45页 |
2.17 小鼠致死实验 | 第45页 |
2.18 重组蛋白的构建以及纯化 | 第45页 |
2.19 微量热泳动仪(MST)检测蛋白与核酸、蛋白与蛋白之间的相互作用 | 第45页 |
2.20 RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RIP) | 第45-46页 |
2.21 病毒DNA结合蛋白免疫沉淀实验 | 第46-47页 |
第3章 实验结果与讨论 | 第47-108页 |
1 研究背景与立项依据 | 第47-49页 |
2 实验结果 | 第49-105页 |
2.1 ZCCHC3调控RLR介导的信号转导机制研究 | 第49-83页 |
2.1.1 过量表达ZCCHC3促进RNA病毒诱导的信号通路 | 第49-50页 |
2.1.2 ZCCHC3的缺失抑制RNA病毒诱导的信号通路 | 第50-53页 |
2.1.3 敲低ZCCHC3抑制RNA病毒诱导的信号通路 | 第53-55页 |
2.1.4 ZCCHC3的缺失不影响IFN-β诱导的信号通路 | 第55-56页 |
2.1.5 Zcchc3基因敲除小鼠鉴定 | 第56-58页 |
2.1.6 在小鼠细胞中,ZCCHC3对RNA病毒诱导的信号转导是必需的 | 第58-63页 |
2.1.7 ZCCHC3对小鼠抗RNA病毒感染引起的免疫应答是必需的 | 第63-65页 |
2.1.8 ZCCHC3与RIG-I/MDA5相互作用 | 第65-68页 |
2.1.9 ZCCHC3结合dsRNA,并促进RIG-I/DMA5结合dsRNA | 第68-73页 |
2.1.10 ZCCHC3促进RIG-I/MDA5发生K63位连接的多聚泛素化 | 第73-81页 |
2.1.11 ZCCHC3促进RIG-I/MDA5 K63位连接的多聚泛素化依赖于TRIM25 | 第81-83页 |
2.2 ZCCHC3调控DNA病毒介导的信号转导机制研究 | 第83-105页 |
2.2.1 过量表达ZCCHC3促进DNA病毒诱导的IFN-β启动子的激活 | 第83页 |
2.2.2 过量表达ZCCHC3协同DNA病毒以及dsDNA诱导的下游基因的转录 | 第83-84页 |
2.2.3 ZCCHC3的缺失抑制DNA病毒及dsDNA诱导的下游基因的转录 | 第84-86页 |
2.2.4 ZCCHC3的缺失抑制HSV-1诱导的TBK1和IRF3的磷酸化 | 第86页 |
2.2.5 ZCCHC3的缺失并不影响IFN-β诱导的信号通路 | 第86-87页 |
2.2.6 在小鼠细胞中,ZCCHC3对DNA病毒诱导的信号转导是必需的 | 第87-92页 |
2.2.7 ZCCHC3在小鼠抗HSV-1感染引起的免疫应答中是必需的 | 第92-94页 |
2.2.8 ZCCHC3作用在cGAMP上游进而调控DNA病毒诱导的信号通路 | 第94-95页 |
2.2.9 ZCCHC3与cGAS相互作用 | 第95-97页 |
2.2.10 ZCCHC3作为重要的辅助受体结合dsDNA,并且促进cGAS结合dsDNA | 第97-103页 |
2.2.11 ZCCHC3促进胞质dsDNA诱导的cGAS寡聚化 | 第103-105页 |
3 总结 | 第105-108页 |
3.1 ZCCHC3正向调控RLR介导的抗病毒天然免疫反应 | 第105-106页 |
3.2 ZCCHC3正向调控DNA病毒介导的天然免疫反应 | 第106-108页 |
第4章 讨论与展望 | 第108-110页 |
参考文献 | 第110-118页 |
缩略语标注表 | 第118-120页 |
作者简历 | 第120-121页 |
攻博期间发表的科研成果目录 | 第121-123页 |
致谢 | 第123-124页 |