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N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺的合成及其抗肿瘤作用的研

【西医学免费毕业论文】作者:秦箐,高明星,莫德欢,王闻楚,林华,邝晓聪【摘要】 目的首次合成未见报道的N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺,探讨其体内外抗肿瘤活性。方法①以芥酸和双(2-氯乙基)胺盐酸盐为原料、吡啶为催化剂合成N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺,分离纯化后核磁共振谱确证结构;②用N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺作用于Tca8113,用倒置显微镜镜下观察其对Tca8113细胞的生长状况的影响,PI染色经流式细胞术分析其杀伤效应;③S180小鼠动物肿瘤模型观察N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对肿瘤的体内抑制作用。结果合成出了N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺并确证了其结构;N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺于体外0.15~10.0 μg/ml的浓度范围对Tca8113有较强的杀伤效应,杀伤率均超过30%,但与浓度递增无明显的正相关,在100.0 μg/ml以上的浓度反而杀伤效果不佳;体内抑制S180的生长,剂量为5 mg/kg时,抑制作用最好,生命延长率为38.20%,体重平均增长速率为2.45%。结论采用微型合成法能够快速、方便地合成出N,N-二
【关键词】 芥酸; N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺; Tca8113; S180; 抗肿瘤作
Abstract:ObjectiveTo study the synthesis of the N,N-di(2-chloroethyl)erucamide and its activity of anti-tumor in vitro and vivo. Methods①Through the micro-organic synthesis technology, erucic acid was coupled with N,N-di(2-chloroethyl)amine hydro-chloride as starting materials, pyridine as catalyst to synthesize the N,N-di(2-chloroethyl)erucamide. Isolation and purification were achieved by silical gel column chromatography, and its structure was confirmed by nuclear magnetic resonance spectrum.②Tca8113 was cultured in media with N,N-di(2-chloroethyl)erucamide,and the cell growth was observed through inverted microscope. The anti-tumor effect was detected by flow cytometry. ③Investigate the growth inhibitory for murine tumormodels in vivo.ResultsThe N,N-di(2-chloroethyl)erucamide was synthesized successfully and its strong killing effect was recorded within 0.15μg/ml~10.0μg/ml in vitro, and the rate was beyond 30%, but the effect had no positive correlation with concentration. The inhibitory concentration 50 % (IC50) was 0.135 38μg/ml . This compound had significant inhibitory effect on S180 growth in vivo. As dose was 5mg/kg, the inhibitory effect was the best, the life-prolonging rate was 38.20%,the average growth rate of body weight was 2.45%. ConclusionThrough the microscale organic synthesis, N,N-di(2-chloroethyl)erucamide can be synthesized quickly and conveniently. N,N-di(2-chloroethyl)erucamide has obvious anti-tumor effect in vitro and in vivo.
Key words: Erucic acid; N,N-di(2-chloroethyl)erucamide; Tca8113; S180; Anti- tumor
为了研究药物的构效关系,我们需合成一系列的高级不饱和脂肪酸类似物,N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺是其中之一。本文选取芥酸为原料,采用经典的酰化反应,使用微型有机合成技术,首次合成出了目标产物。
国内外学者从机制、临床意义等多方面对氮芥类药物抗肿瘤进行了大量的研究,目前临床上使用的氮芥类抗肿瘤药物有环磷酰胺、苯丁酸氮芥等[1]。而大多数抗肿瘤药物在有效剂量范围内的毒性比较大,有肾毒性、免疫抑制等不良反应。为了征服癌症,延长癌症病人的生存时间和提高生活质量,寻找低毒、高效、构效明确的抗肿瘤药物是目前肿瘤治疗中迫切需要解决的问题。
在我们的前期工作中,已发现了具有免疫调节活性的板蓝根组酸(又名板蓝根高级不饱和脂肪酸)[2],且其具有较好的体内外抗肿瘤活性[3~5]。为了研究板蓝根组酸的抗肿瘤定量构效关系,我们合成了一系列类似物并研究了其抗肿瘤活性[6~9]。我们还发现芥酸等高级脂肪酸具有较好的载体作用。
我们进而以芥酸和双(2-氯乙基)胺盐酸盐为原料,采用经典的酰化反应,选择微型有机合成技术首次合成了N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺。我们还合成了一系列的板蓝根组酸类似物,期望经过结构改造,能合成新的活性药物及改善药物的通透性。
1 材料与仪器
1.1 试剂与仪器芥酸(由四川天宇油脂化学有限公司提供),氯化亚砜(AR,汕头西陇化工),双(2-氯乙基)胺盐酸盐(AR,保定加合精细化工有限公司),吡啶(AR,广东光华化学厂有限公司),四氢呋喃(AR,广东光华化学厂有限公司),二氯甲烷(AR,广东光华化学厂有限公司),醋酸乙酯(AR,广东汕头市西陇化工),石油醚(AR,广东光华化学厂有限公司),薄层层析用硅胶H(CP,青岛海洋化工有限公司),RPMI-1640培养基(HyClone公司),胎牛血清(HyClone公司),无水乙醇(AR,广东汕头市西陇化工)。
1.2 仪器AE240双量程分析天平(METTLER-TOLEDO),瑞士布鲁克AVANCE AV 500MHZ超导核磁共振谱仪,ML-902定时、恒温磁力搅拌器(上海浦江分析仪器厂),MERCK板,倒置显微镜(Leica,301-185.104-000),Epics XL流式细胞仪(美国Coulter公司)。
1.3 细胞株Tca8113细胞株(广西医科大学病理生理实验室提供),S180(购于中国科学院上海细胞库)。
1.4 实验动物BALB/c小鼠,18~22 g,10只;KM小鼠,18~22 g,雌雄各半,共50只。由广西医科大学实验动物中心提供。
 
2 方法与结果
2.1 N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺的合成在 20ml微型二口烧瓶中加入芥酸11.8 mmol(4.0 g),加入氯化亚砜41.4 mmol(3.0 ml),吡啶两滴。磁力搅拌70°C反应4 h。抽干氯化亚砜,加入四氢呋喃6ml和双(2-氯乙基)胺盐酸盐16.8 mmol(3.0 g),室温反应12 h,至薄谱层析显示原料几乎完全转化时停止[10]。反应停止后,反应混合液加入pH 3~4的盐酸水溶液30 ml,振荡30 min,然后加入20 ml二氯甲烷,待混合物分成两相,弃上层;下层用pH 3~4的盐酸水溶液10 ml,洗涤两次,弃上层水洗液,干燥。
反应方程式如下:
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH+SOCl2Pyridine70℃,4h
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COCl(ClCH2CH2)2NH·HClTHF,r.t.,12h
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11CONCH2CH2ClCH2CH2Cl
2.2 分离纯化取粗产物2.0 g,酸性氧化铝70 g,常压硅胶柱层析法,用石油醚-醋酸乙酯(99∶1)进行淋洗。分段收集,TLC法检测,合并相同流分,回收溶剂。分离得无色化合物0.50 g。
产物以1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定。
2.3 结构鉴定产物以1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm:5.36(2H,m,-CH=CH-),4.12(4H,s,-N-CH2-),3.58(4H,s,-N-C-CH2-),2.31(2H,t,-CH2-CON-),2.03(4H,m,-CH2-C=C-CH2-),1.62(2H,m,-CH2-C-CON-),1.30[24,m,-(CH2)n-],0.88(3H,t,CH3-C-)。
13C-NMR(500MHz,CDCl3)δppm:173.767,130.327,129.869,63.306,44.376,,34.308,31.900,29.769,29.655,29.593,29.536,29.515,29.456,29.308,29.251,29.196,29.158,27.206,26.129,24.979,22.664,22.7。
根据反应物结构,综合以上光谱数据,鉴定该化合物为目标产物N,N-二(2-氯乙基) 芥酸酰胺。
2.4 体外抗肿瘤作用的研究将对数生长期的Tca8113细胞以0.25%的胰蛋白酶消化,调整细胞浓度为1×105个/ml,置于12孔培养板, 1 ml/well,于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。将不同浓度的样品加入不同的孔,配好的样品微乳液的浓度依次为500,300,200,100,50,10,5,1.5,0.5,0.15 μg/ml,阳性对照加入阿霉素,空白对照加等体积的10%胎牛血清的RPMI1640培养基,阴性对照加入与配药所用相同比例的溶剂和培养基,每个浓度做两个复孔。混匀,37℃、5%CO2培养箱中培养24 h,于倒置显微镜下观察细胞形态,收集所有细胞(包含上清液中漂浮的细胞),加入PI染液,室温、避光孵育30 min,流式细胞仪检测PI自发荧光强度以判断细胞死亡率。
N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺作用于Tca8113细胞,在0.15~10.0 μg/ml的浓度范围有较强的杀伤效应,镜下观察细胞变圆,贴壁性能减弱,细胞上浮明显,细胞克隆生长状态受抑制,而且细胞收缩,折光度变差,未能保持上皮样生长方式,如图1~2所示。经流式细胞仪检测结果显示与上述一样,其在0.15~10.0 μg/ml的浓度范围有较强的杀伤效应,杀伤率均超过30%,但与浓度递增无明显的正相关,在100.0 μg/ml以上的浓度反而杀伤效果不佳。结果见表1。表1 化合物N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺体外对TCA8113细胞杀伤效应(略)
2.5 体内抗肿瘤作用的研究S180经细胞培养体外扩增,在BALB/c小鼠腹腔内传代,取第4代的腹水细胞,用0.9%氯化钠洗涤两次,将细胞浓度调整至1×108·ml-1,接种于KM鼠腹腔,0.2 ml/只。接种24 h后腹腔注射给药,N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺分高、中、低3个剂量(7.5,5,2.5 mg/kg),1次/d,连续给药,直到死亡。计算体重增加率、平均存活时间和生命延长率。实验中设阳性对照组(环磷酰胺10 mg/kg)及阴性对照组。
实验结果表明,N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对小鼠S180腹水瘤生长有一定的抑制作用,结果见表2。中剂量5 mg/kg时,其存活时间与阴性对照组和阳性对照组相比均有差异,且差异有统计学意义,P值分别为0.001和0.008;生命延长率为38.20%,与阳性对照组相比差异有统计学意义(P=0.008);受试组体质量增加率也明显降低,中剂量组体质量平均增长速率为2.45%。表2 N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对KM小鼠S180腹水瘤的抑制作用(略)
  3 讨论
经核磁共振谱证实终化合物为目标产物,并且是一种新的化合物。
在体外的抗肿瘤实验中,我们将N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺作用于Tca8113细胞,并进行了定性及定量观察。首先对癌细胞生长状态,包括细胞形态、生长方式的影响进行观察,然后经流式细胞仪作定量检测。结果表明,N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对Tca8113细胞在较低浓度范围有明显的杀伤作用,在100.0 μg/ml以上的浓度反而杀伤效果不佳。在体内实验中,N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺5.0 mg/kg对S180腹水瘤有明显的抑制作用,能很大程度上延长小鼠的存活时间。体内外实验结果一致,此结果表明药物浓度递增与杀伤作用无明显的正相关。
脂肪酸由于具有脂溶性大,能透过组织进入肿瘤细胞内和靶器官;其分子量较大,化学性质活泼,所以不仅能直接作为抑制肿瘤的药物,也能作为一种载体,携带药物进入到靶器官;也能经过结构改造,合成新的活性更强的药物。有研究报告[11,12],由磷脂、胆固醇和油酸所组成的油酸多相脂质体(PL139)是与生物膜类似超微粒球状体,作为载体能携带药物进入细胞内,能提高巨噬细胞的吞噬功能。脂质过氧化产生的活性氧能提高肿瘤细胞对药物的敏感性[13],产生的自由基和脂质过氧化物则可抑制肿瘤细胞的表达,缩短染色体的端粒,促进肿瘤细胞的凋亡[14]。氮芥类化合物能与DNA碱基共价结合而产生DNA的交叉联结,而主要与DNA分子大沟中(DNA major groove)的鸟嘌呤的N反应,使DNA分子因发生交叉联结而断裂,从而干扰DNA的复制或转录[15, 16]。N,N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺是一种脂肪酸,其杀伤肿瘤细胞的机理可能是以一种载体进入细胞内,使DNA结构和功能发生改变,阻止DNA复制,造成细胞DNA损伤,杀伤肿瘤细胞。
综上所述,N,N-(2-氯乙基)芥酸酰胺在体内外都具有很明显的抗肿瘤作用,不具有浓度依赖性,是肿瘤化疗极具潜力的药物,其抗肿瘤机制有待进一步深入研究,具有一定的实际应用意义。
致谢:本研究受到广西大型仪器协作共用网资助。
【参考文献】
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