| 中文摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 引言 | 第16-19页 |
| 第一部分 文献综述 | 第19-34页 |
| 第一章 鸡传染性法氏囊病病毒细胞受体研究现状 | 第19-26页 |
| 1 鸡传染性法氏囊病毒的生物学特性 | 第19-20页 |
| 2 病毒细胞受体 | 第20-23页 |
| ·病毒受体的研究意义 | 第20-21页 |
| ·病毒细胞受体的类别及生物学功能 | 第21-23页 |
| 3 IBDV细胞受体的研究进展 | 第23-26页 |
| 第二章 病毒细胞受体研究的生物技术途径 | 第26-34页 |
| 1 受体单克隆抗体亲和层析 | 第26-27页 |
| 2 病毒覆盖蛋白印迹技术(Virus overlay protein blot assay,VOPBA) | 第27页 |
| 3 免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation,Co-IP) | 第27-28页 |
| 4 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system,YHS) | 第28-29页 |
| 5 噬菌体表面展示技术(Phage surface display techniques,PSDT) | 第29-30页 |
| 6 cDNA文库 | 第30-32页 |
| 7 流式细胞术 | 第32页 |
| 8 GST Far Western blotting和GST沉降技术(GST Pull-down) | 第32-33页 |
| 9 质谱分析 | 第33-34页 |
| 第二部分 研究内容 | 第34-116页 |
| 第一章 鸡B细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定 | 第34-44页 |
| 1 材料与方法 | 第34-38页 |
| ·材料、质粒和菌株 | 第34-35页 |
| ·鸡B细胞mRNA的提取 | 第35页 |
| ·双链cDNA合成 | 第35-37页 |
| ·cDNA克隆到T7载体及体外包装 | 第37页 |
| ·噬菌斑试验测定文库滴度 | 第37页 |
| ·重组子鉴定 | 第37-38页 |
| ·文库扩大培养及滴度测定 | 第38页 |
| ·文库质量鉴定 | 第38页 |
| 2 结果 | 第38-41页 |
| ·鸡B细胞mRNA的提取与分离 | 第38-39页 |
| ·双链cDNA的鉴定及分级分离 | 第39-40页 |
| ·初始文库的滴度和重组子测定 | 第40页 |
| ·文库扩增后的滴度测定及插入片段大小分析 | 第40-41页 |
| 3 讨论 | 第41-43页 |
| ·cDNA文库是发现新基因和研究基因功能的重要工具 | 第41页 |
| ·cDNA文库的构建方法 | 第41-42页 |
| ·cDNA的分级分离 | 第42页 |
| ·cDNA文库的质量评价 | 第42-43页 |
| 4 小结 | 第43-44页 |
| 第二章 传染性法氏囊病毒对鸡B细胞T7噬菌体表达文库的亲和筛选 | 第44-56页 |
| 1 材料与方法 | 第44-48页 |
| ·毒株、试剂和工具酶 | 第44-45页 |
| ·IBDV病毒的分离、纯化及效价测定 | 第45页 |
| ·鸡B细胞cDNA文库的生物淘选 | 第45页 |
| ·噬菌斑印迹(Plaque lift)检测病毒亲和性噬菌体 | 第45-46页 |
| ·高亲和单克隆噬菌体的扩大培养 | 第46页 |
| ·Phage-ELlSA检测噬菌体阳性克隆 | 第46页 |
| ·亲和噬菌体插入序列的扩增 | 第46页 |
| ·亲和噬菌体插入序列的测序 | 第46-48页 |
| ·序列测定及分析 | 第48页 |
| 2 结果与分析 | 第48-53页 |
| ·T7噬菌体表达文库的生物淘选及特异性噬菌体的富集 | 第48-49页 |
| ·噬菌体克隆与病毒结合特性分析 | 第49-50页 |
| ·测序结果及氨基酸序列分析 | 第50-53页 |
| 3 讨论 | 第53-54页 |
| ·噬菌体表达文库的筛选方法 | 第53页 |
| ·用于文库筛选的IBDV毒株选择 | 第53-54页 |
| ·高亲和噬菌体的筛选与鉴定 | 第54页 |
| ·亲和噬菌体外源基因的序列分析 | 第54页 |
| 4 小结 | 第54-56页 |
| 第三章 鸡Igλ轻链跨膜嵌合分子真核表达载体构建及在COS7细胞表达 | 第56-80页 |
| 1 材料与方法 | 第57-67页 |
| ·细胞、质粒和试剂 | 第57-58页 |
| ·鸡Igλ轻链(cIgλ)与牛Ig G Fc受体γRⅡ跨膜区(R2T)嵌合分子(λR2T)的获得 | 第58页 |
| ·构建带有cIgλ信号肽SP中间载体pEGFP-Cl-SP | 第58-60页 |
| ·λR2T跨膜分子绿色荧光蛋白基因重组表达载体pEGFP-C1-SP-λR2T的构建 | 第60-63页 |
| ·分泌型真核表达载体pEGFP-Cl-SP-λ的构建及表达蛋白鉴定 | 第63-65页 |
| ·λR2T嵌合跨膜分子重组表达载体pcDNA3-λR2T的构建和COS7细胞膜定位表达 | 第65-66页 |
| ·分泌型真核表达重组载体pcDNA3-λ的构建与表达 | 第66-67页 |
| 2 结果与分析 | 第67-76页 |
| ·带信号肽SP中间载体pEGFP-C1-SP的构建 | 第67-68页 |
| ·鸡Igλ轻链与牛IgG Fc受体λRⅡ跨膜区嵌合跨膜分子(λR2T)的形成 | 第68-69页 |
| ·λR2T绿色荧光蛋白重组跨膜分子融合基因的构建 | 第69-70页 |
| ·λR2T重组跨膜分子在COS7细胞膜上的定位表达 | 第70页 |
| ·分泌型鸡Igλ cDNA/GFP重组表达载体的构建 | 第70-72页 |
| ·鸡λ/GFP重组分子在COS7细胞上的分泌表达 | 第72页 |
| ·鸡λ/GFP表达蛋白的Western blotting鉴定分析 | 第72-73页 |
| ·λR2T嵌合跨膜分子重组表达载体pcDNA3-λR2T的构建 | 第73-74页 |
| ·流式细胞术检测pcDNA-λR2T在COS7细胞膜的表达 | 第74-75页 |
| ·重组表达载体pcDNA3-λ的构建及COS7细胞分泌表达鉴定 | 第75-76页 |
| 3 讨论 | 第76-78页 |
| ·GFP的细胞定位和示踪 | 第76-77页 |
| ·信号肽对多肽链的引导作用 | 第77页 |
| ·跨膜区对蛋白膜定位表达的锚定功能 | 第77页 |
| ·带信号肽SP载体pEGFP-C1-SP的构建 | 第77-78页 |
| ·重组质粒在COS7细胞系的表达 | 第78页 |
| 4 小结 | 第78-80页 |
| 第四章 重组鸡Igλ轻链原核细胞表达及抗鸡Igλ轻链单克隆抗体制备与功能鉴定 | 第80-90页 |
| 1 材料与方法 | 第80-84页 |
| ·试剂、培养基及工具酶 | 第80-81页 |
| ·鸡Igλ轻链基因的原核表达载体构建及表达 | 第81-82页 |
| ·抗鸡Igλ轻链单克隆抗体制备 | 第82-84页 |
| 2 结果与分析 | 第84-87页 |
| ·鸡Igλ轻链基因PCR扩增产物 | 第84页 |
| ·酶切鉴定 | 第84-85页 |
| ·重组蛋白的表达和Western blot鉴定 | 第85-86页 |
| ·单抗与B细胞反应的特异性 | 第86-87页 |
| ·单抗与鸡Igλ反应的特异性 | 第87页 |
| 3 讨论 | 第87-89页 |
| ·外源基因表达体系的选择 | 第87-88页 |
| ·外源基因的原核表达 | 第88页 |
| ·Balb/C小鼠免疫方法和抗原选择 | 第88页 |
| ·杂交瘤细胞株的筛选方法 | 第88页 |
| ·Western blotting鉴定mAb的特异性 | 第88-89页 |
| 4 小结 | 第89-90页 |
| 第五章 鸡Igλ轻链作为病毒B细胞受体的生物学功能鉴定 | 第90-103页 |
| 1 材料与方法 | 第90-92页 |
| ·细胞和质粒 | 第90页 |
| ·主要试剂 | 第90页 |
| ·病毒覆盖蛋白印迹(Virus overlay protein blot assay,VOPBA) | 第90-91页 |
| ·病毒与细胞的结合试验 | 第91页 |
| ·竞争/抑制试验 | 第91-92页 |
| ·病毒感染试验 | 第92页 |
| 2 结果与分析 | 第92-97页 |
| ·VOPBA鉴定IBDV病毒与鸡重组Igλ蛋白结合的特异性 | 第92-93页 |
| ·病毒与细胞表面Igλ的结合特性分析 | 第93-95页 |
| ·重组鸡Igλ轻链、抗Igλ单抗对病毒结合的竞争/抑制作用 | 第95-97页 |
| ·鸡Igλ轻链在病毒感染细胞中的作用 | 第97页 |
| 3 讨论 | 第97-99页 |
| ·研究IBDV细胞受体的目的和意义 | 第97-98页 |
| ·关于IBDV细胞受体的研究 | 第98-99页 |
| ·本项目中关于IBDV B细胞受体研究取得的成果 | 第99页 |
| 4 小结 | 第99-103页 |
| 参考文献 | 第103-116页 |
| 第三部分 附录 | 第116-125页 |
| 附录A 常用试剂及仪器 | 第116-119页 |
| 附录B 常用试剂及培养基配制 | 第119-123页 |
| 附录C 攻博期间论文、项目及获奖情况 | 第123-125页 |
| 致谢 | 第125页 |
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