logo
教育论文中心  教育论文中心   广告服务  广告服务   论文搜索  论文搜索   论文发表  论文发表   会员专区  会员专区   在线购卡   在线购卡   服务帮助  服务帮助   联系我们  联系我们   网站地图  网站地图   硕士论文  会员专区   博士论文
当前位置:教育论文中心首页--防疫医学论文--雌二醇的免疫胶体金试纸法检测药学
推荐论文
免疫胶体金试纸检测研究
牛源金黄色葡萄球菌免疫胶体金试纸
免疫胶体金试纸快速联检出血性
犬细粒棘球绦虫感染Dot-ELI
雌二醇免疫胶体金试纸检测
猫弓形虫感染ELISA和胶体金
A群轮状病毒单克隆抗体及免疫胶体
布鲁氏菌种特异性抗原抗体免疫胶体
猪尿中磺胺类药物残留胶体金试纸
ELISA胶体金试纸检测H
鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体制备
犬心丝虫MTFP抗原定位及Dot
基于rMPSP牛泰勒虫病试纸
1991~2004年间IBDV山
 
站内搜索
 
 
科目列表
市场营销 管理理论 人力资源
电子商务 社会实践 先进教育
伦理道德 艺术理论 环境保护
农村研究 交通相关 烟草论文
电子电气 财务分析 融资决策
电影艺术 国学论文 材料工程
语文论文 数学论文 英语论文
政治论文 物理论文 化学论文
生物论文 美术论文 历史论文
地理论文 信息技术 班主任
音乐论文 体育论文 劳技论文
自然论文 德育管理 农村教育
素质教育 三个代表 旅游管理
国际贸易 哲学论文 工商管理
证券金融 社会学 审计论文
会计论文 建筑论文 电力论文
水利论文 园林景观 农林学
中医学 西医学 心理学
公安论文 法学法律 思想汇报
法律文书 总结报告 演讲稿
物业管理 经济学 论文指导
计算机 护理论文 社会调查
军事论文 化工论文 财政税收
保险论文 物流论文 语言教育
教育教学 给水排水 暖通论文
结构论文 综合类别 硕士论文
博士论文    
 
 
 
雌二醇的免疫胶体金试纸法检测药学

【防疫医学论文】 【关键词】 雌二醇 雌二醇(17β-Estradiol)是天然雌激素的重要成分,为防止儿童性早熟等 问题 ,食品中尤其是畜禽产品的雌二醇检测不容忽视。胶体金免疫层析技术(GICA)在检测小分子有机物方面越来越受到重视。其基本原理是胶体金颗粒能够稳定吸附蛋白质,而蛋白质的生物活性无明显变化,所以它可以取代酶标记抗体〔1,2〕。本实验采用标记有雌二醇单克隆抗体的胶体金颗粒与相对应的固定在硝酸纤维膜上的雌二醇结合物相结合,固定有雌二醇结合物的检测线处就显现明显的颜色〔3,4〕。本法具有灵敏度高、特异性强、简便快速、成本较低、结果容易判读等优点,适用于样品的初步筛选。 1 材料与 方法 11 试剂与仪器 氯金酸(上海化学试剂厂);牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗(天津联星生物公司);雌二醇标准品、雌二醇单抗、17β-Estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)美国Sigma公司);其他试剂均为国产 分析 纯。硝酸纤维膜、玻璃纤维膜(美国Millipore公司);Beckman Du530分光光度计(德国Beckman公司);低温高速离心机(军事医学 科学 院);点膜机(美国Bio-Dot公司)。 12 方法 121 胶体金的制备 用三蒸水溶解氯金酸,使其终浓度为01g/L。先进行沸水浴,待氯金酸溶液煮沸后,每100ml加入1%柠檬酸三钠25ml,再沸水浴下快速搅拌,直到氯金酸溶液的颜色稳定,继续沸水浴10min〔5〕,冷却至室温后,用透射电镜镜检并用分光光度计检测颗粒均匀度及粒度。最后置于4℃冰箱保存备用。 122 最适标记蛋白量的确定 用02mol/L K2CO3将胶体金溶液调至pH为82,然后取试管9支,分别加入10ml胶体金溶液。将雌二醇抗体逐级稀释后,各取等体积稀释液顺序加入上述试管中,混匀,另设一不加抗体的对照管。放置10min,在各管中加入01ml的10%NaCl,混匀后静置2h。观察各管中胶体金溶液变化,未加蛋白及加入量不足的溶液颜色由红变蓝,而加入蛋白量达到或超过时的溶液则保持不变。标记蛋白量即为最低稳定胶体金溶液不变色的蛋白量基础上再加20%。 123 胶体金探针的标记 将抗体用0005mol NaCl溶液透析过夜,离心除去蛋白沉淀,调至05mg/ml。取胶体金100ml,用0,2mol/L K2CO3将胶体金溶液调至pH为90,磁力快速搅拌下缓慢加入24ml稀释的雌二醇抗体,继续搅拌10min,加入牛血清白蛋白(BSA),使其最终浓度为1%,再搅拌10min。将初步制得的胶体金探针以4000r/mm离心20min;弃沉淀,上清以10000r/min离心60min;弃上清,沉淀用001mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)(含1%牛血清白蛋白)重新悬浮;同前离心洗涤2次,将沉淀用001mol/L的PBS(pH82,含1%BSA,002%NaN3)悬浮,4℃保存备用。 124 抗原的合成 小分子物质难以固定在硝酸纤维膜上,只有使它连上大分子物质才能较好地固定。本实验采用混合酸酐法制备完全抗原。雌二醇-6-肟43mg,加入三正丁胺50μl,二氧六环4ml,冰浴冷却到10℃以下,加入氯甲酸乙酯15μl〔6〕。4~10℃下反应30min。配制卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA 10mg,3ml水,3ml二氧六环,1mol/L氢氧化钠03ml)。将配制好的OVA溶液加入反应液,4℃冰浴搅拌6h,反应过程中,用氢氧化钠维持pH值为8。反应完毕后,将反应液加入透析袋,透析2d。将透析液调至pH45,冰箱4℃,放置4天,有黄色沉淀出现。离心收集沉淀,冷冻干燥,4℃冰箱保存。将OVA溶于透析液内作为参比,用紫外光谱法对雌二醇-6肟-OVA进行定性检验。经紫外测定证明蛋白质已与雌二醇衍生物结合。 125 胶体金免疫层析试纸条制备 测试条由玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、加样纸、吸水纸4部分组成。将玻璃纤维膜裁成6mm的细条,然后放入含1%BSA、1%Tween-20的PB液中浸泡30min,37℃烘干,最后将胶体金探针灌注已处理好的玻璃纤维膜上,真空干燥备用。在硝酸纤维膜上用点膜机将上述抗原和兔抗鼠IgG喷成2条线,分别为检测线和对照线,经真空干燥后,用1%BSA、001mol/L PBS(pH90)封闭2h,以001mol/L PBS洗涤,再真空干燥。将30mm吸水纸、25mm硝酸纤维膜、6mm玻璃纤维膜、15mm加样纸,由顶部依次粘于PVC板上,裁成细条备用。 126 检测与判读 样品:含已知浓度雌二醇样品的乙醇溶液分为3组,第1组不加雌二醇,第2组为02μg/ml雌二醇,第3组为04μg/ml雌二醇。将加样纸一端插入待测液,湿润后取出,水平放置,约3~5min,观察结果。如试纸条硝酸纤维膜上仅对照线呈一条紫红色带为阳性;如出现2条紫红色带为阴性;如质控线不出现紫红色带,无论检测线是否出现,测试结果均无效。 2 结果与 分析 21 胶体金颗粒大小选择 胶体金颗粒吸附蛋白并显示检测结果,其大小是重要 影响 因素之一。胶体金颗粒的大小,由制备胶体金时加入的柠檬酸三钠量决定,当柠檬酸三钠加入越多,胶体金颗粒也越多,但颗粒直径越小,反之胶体金颗粒越大。胶体金颗粒小,结合蛋白量少,反应结合率低,另外难以显示明亮清晰的颜色,影响显色效果;胶体金颗粒大,其结合蛋白后不稳定,不易保存,另外其结合蛋白后难以通过膜〔7〕。本实验选用的胶体金颗粒直径约为15min,既可以通过膜,反应彻底,又易保存,反应结果显色清晰。 22 胶体金颗粒鉴定 胶体金颗粒大小及均一程度是检测结果可靠的基础,制备完毕后须经质量鉴定才能 应用 。用Beckman Du530分光光度计对胶体金进行扫描,发现其主峰宽度较小,表明制备的胶体金颗粒较均匀,λmax为520nm(图1),表明其粒度约为15nm〔8〕。用电镜观测结果(图2)与分光光度计测定结果一致。电镜观测是鉴定胶体金颗粒粒径及分布的标准,但这种 方法 不便用于日常工作使用,而用分光光度计测定操作简便,更适合实验室日常使用。 图1 胶体金的可见光谱图(略) 23 最适蛋白量 阴性对照为未加抗体管,1~7管抗体浓度分别为10,12,14,16,18,20,22μg/ml,阳性对照为胶体金溶液。可见,本实验最适标记蛋白量为20μg/ml(图3)。 24 E2-OVA浓度 用PBS(pH74)溶解E2-OVA浓度为005~10mg/ml,喷在硝酸纤维膜上作检测线,发现E2-OVA浓度越高,检测液中也需要越高浓度的E2与之竞争,检测灵敏度也就越低。但是,E2-OVA浓度低于05mg/ml,检测线颜色太弱,难用肉眼分辨。 图2 胶体金电镜图(略) 阴性对照为未加抗体管;阳性对照为胶体金溶液 图3 胶体金与雌二醇抗体结合浓度确定实验(略) 25 检测限 本实验的检测限是以完全看不见检测线为最低检测限〔9〕。将雌二醇标准品用甲醇配制成04,02,01,005μg/ml 4个标准溶液,用上述检测方法进行检测(图4)。由图可见,最低检测线为100ng/ml。 图4 试纸条检测样品(略) 26 对比实验 取30份样品,检测分为3组,第1组不加雌二醇,第2组加02μg/ml雌二醇,第3组加04μg/ml雌二醇,分别用GICA法与气质联用法(GC/MS)检测。实验结果显示,第1组2种方法均未检出;第2组GICA法阳性9粒,阴性1粒,GC/MS法阳性10粒;第3组2种方法均检测阳性。由此可见,与标准检测方法相比,GICA法准确度为9667%。 27 交叉反应试验 实验结果显示,与己烯雌酚、炔雌酚、壬基酚、阿特拉津及双酚A等环境内分泌干扰物中的环境雌激素无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。 3 小结 目前 ,关于雌二醇的检测有气、液相色谱和光谱、质谱等方法,但其仪器昂贵、操作复杂、检测时间较长。本文建立的免疫胶体金层析法具有灵敏度高、特异性强、简便快速、成本较低、结果容易判读等优点,且无需任何仪器,操作简单,适用于样品的初步筛选。 参考 文献 〔1〕 Dykman LA,Bogatyrev VA.Colloidal gold in solidphase assays[J].Biochemistry (Moscow),1997,62:350-356. 〔2〕 Hayat MA.In Colloidal Gold: Principles,Methods and Applications; Academic Press[M].San Diego Avcad Press,1989:15-19. 〔3〕 Horton JK,Swinburne S,OSullivan MJ.A novel rapid,single-step immunochromatographic procedure for the detection of mouse immunoglobulin J[J].Immunol Methods,1991,140:131-134. 〔4〕 Dequaire M,Degrand C,Lmaoges B.An electrochemical,metalloimmunoassay based on a colloidal gold label[J].Anal Chem,2000,72:5521-5528. 〔5〕 Horisberger M,Rosset J.Colloidal gold,a useful marker for transmission and scanning electron microscopy J[J].Histochem Cytochem,1997,25(4):295. 〔6〕 姜玲,章文才,柯云,等.抗槲皮素抗体的研制[J]. 中国 免疫学杂志,2000,16(5):383-385. 〔7〕 Deng Y P,Zhao H Q,Jiang L,Applications of nanogold particles in biomimetic engineering[J].China Basic Sci,2000,9:1-17. 〔8〕 彭剑淳,刘晓达,丁晓萍.可见光光谱法评价胶体金粒径及分布[J].军事医学 科学 院院刊,2000,24(3):11. 〔9〕 Pei Zhou,Yitong Lu.Nanocolloidal gold-based immunoassay for the detection of the N-Methylcarbamate pesticide carbofuran[J].Agric Food Chem,2004,52:4355-4359.
 
 
 
 您可能感兴趣的论文
论文标题页/字数分类
尤氏泰勒虫TuIP、Tu88蛋白特性分析及其应用47页硕士论文
免疫胶体金法定量检测TSH在妊娠期甲状腺功能减退症人群中应用35页硕士论文
基于纳米量子点标记肿瘤标志物检测系统研究140页博士论文
甲胎蛋白胶体金试纸定量检测系统建立及初步应用56页硕士论文
针对禽流感N5、N8、N9三种神经氨酸酶NA蛋白单克隆抗体及N5胶体金59页硕士论文
基于机器视觉胶体金试纸条显色分析仪58页硕士论文
正确解释试纸检测HCG结果其它医学1403字期刊论文
正确解释试纸检测HCG结果1403字期刊论文
试纸在食品及农业检测应用3667字期刊论文
胶体金试纸光电检测仪器研制59页硕士论文
鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试纸条研制及初步应用87页硕士论文
诊断鹅副黏病毒病免疫胶体金试纸制备及初步应用74页硕士论文
胶体金试纸条现场可视化检测中药中黄曲霉毒素B1研究71页硕士论文
玉米赤霉烯酮单克隆抗体制备及高通量定性、定量检测技术研究188页博士论文
基于核酸适配体技术对食品中吊白块胶体金试纸条研究83页硕士论文
试纸检测铜(Ⅱ)61页硕士论文
乙型脑炎免疫胶体金快速检测试纸初步研制69页硕士论文
两种重要兽药残留物胶体金试纸研制及工艺优化62页硕士论文
IBV双抗体夹心ELISA检测方法建立及免疫胶体金试纸研制46页硕士论文
化学免疫胶体金检测粪潜血比较1660字期刊论文
基于免疫胶体金标记技术检测研究及其在堆肥中应用展望6529字期刊论文
19-去甲睾酮胶体金免疫层析试纸研制48页硕士论文
磺胺二甲嘧啶胶体金免疫层析试纸研制56页硕士论文
免疫胶体金便隐血试验在大肠癌普查中应用2168字期刊论文
ELISA胶体金试纸在乙肝表面抗原检测应用研究47页硕士论文
甜瓜细菌性叶枯病胶体金免疫试纸研发与应用60页硕士论文
用ELISA评价胶体金测试卡检测乙型肝炎病毒血清标志物两对半性能1731字期刊论文
 
 
| 会员专区 | 在线购卡 | 广告服务 | 网站地图 |
版权所有 教育论文中心 Copyright(C) All Rights Reserved
联系方式: QQ:277865656 或写信给我