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蛙血清小分子肽的分离鉴定及生物活性检测

【检验毕业论文范文】研究表明,动物血清的主要药理活性成分是小分子肽[1]。笔者的前期研究发现蛙血清去蛋白提取物能提高心、脑组织对缺氧的耐受力[2],能保护心、脑缺血再灌注损伤[3-4],说明其含有对心脑缺血缺氧性损伤有保护作用的小分子肽类物质。因此,本研究从蛙血清去蛋白提取物中分
 研究表明,动物血清的主要药理活性成分是小分子肽[1]。笔者的前期研究发现蛙血清去蛋白提取物能提高心、脑组织对缺氧的耐受力[2],能保护心、脑缺血再灌注损伤[3-4],说明其含有对心脑缺血缺氧性损伤有保护作用的小分子肽类物质。因此,本研究从蛙血清去蛋白提取物中分离并纯化其中的小分子肽,鉴定小分子肽的分子质量,以期确定其分子结构和名称,并通过测定和计算小分子肽的呼吸活性和刺激指数(SI),探讨该小分子肽的药效。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级雄性豚鼠1只,体重250~350 g,由广东医学院实验动物中心提供[合格证号:SYXK(粤)2013-0007]。
1.2 药品试剂
色谱纯乙腈(北京汇海科仪科技有限公司);三氟乙酸(TFA,Sigma公司);10%氢氧化钠溶液(分析纯,广州化学试剂厂);Soerensen缓冲液(0.0667 mol/L):称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O,分析纯,广州化学试剂厂)9.72 g和磷酸二氢钾(KH2PO4,分析纯,广州化学试剂厂)1.65 g加双蒸水至1000 mL,磷酸调pH值到7.4;Brodie测压液:取氯化钠(分析纯,广州化学试剂厂)23 g,牛胆酸钠(分析纯,北京化学试剂公司)5 g,伊文兰(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)100 mg,加双蒸水至500 mL;小牛血清去蛋白注射液(参考对照药,锦州奥鸿药业有限公司,规格:5 mL∶0.2 g)。
1.3 仪器设备
光学显微镜(日本Olympus公司);Ultraflex TOF/TOF型MALDI-TOF Mass(Matrix-assisted Laser Desorption/ioniza-tion time-of-flight)质谱仪(德国Bruker);MILLIPORE8400超滤杯(MILLIPORE),RMM1000和RMM3000超滤膜(MILLIPORE);SKW-3微量呼吸检压仪器(上海大学);YQ3型高速匀浆机(江苏江阴县祝塘仪器厂);恒温水浴箱(余姚电讯仪表实业公司);旋涡混匀器(江苏海门麒麟医用仪器厂)。 1.4 蛙血清小分子肽的分离和鉴定
1.4.1 超滤 蛙血离心取上清,乙醇去蛋白,蒸馏回收乙醇,得蛙血清去蛋白提取物。将其倒入超滤杯中进行超滤[5]。用截留相对分子质量为3000的超滤膜超滤,收集滤过液,再用截留相对分子质量为1000的超滤膜超滤,收集滤膜上保留液,低温保存。
1.4.2 RP-HPLC分离纯化 分离柱:Sepax C18柱;洗脱液A为0.1%三氟乙酸(TFA)/H2O,洗脱液B为0.1%三氟乙酸(TFA)/乙腈;流速为1.0 mL/min,检测波长为215 nm,柱温箱温度为40℃。每次上样100 μL,收集洗脱峰,用质谱仪鉴定洗脱峰中物质的分子量[6]。
1.4.3 质谱分析 在MALDI-TOF/TOF Mass质谱仪上进行一级质谱(MS)和串联质谱(MS/MS)分析[6]。CCA基质:0.1%TFA、50%ACN、50%H2O。取1 μL样品与3 μL CCA基质混合均匀,取0.5 μL混合液在按规律分别在板上点样,风干后送入机内检测。MS:正离子检测模式,离子源加速电压为20 kV,N2激光波长337 nm,脉冲宽度3 ns,离子延迟提取150 ns,真空度4×10-7 Torr。转化MS/MS模式后,将满足MS的离子进行串联质谱分析,MS/MS模式的m/z范围为0~3000。
1.4.4 小分子肽的鉴定 用Mascot软件的串级质谱数据和序列标签进行搜索鉴定[8]。
1.5 蛙血清小分子肽呼吸活性的测定
1.5.1 肝匀浆的制备 雄性豚鼠1只,体重295 g,禁食24 h后颈椎脱臼处死,颈动脉放血,开腹取出肝脏,置冰水浴中的Soerensen缓冲液中。称取5.5 g的肝脏,并切割为大小相同的7块,每块用7 mL的Soerensen缓冲液匀浆。以上操作均在冰水浴中进行。
1.5.2 测定方法 把测压计和反应瓶洗净,干燥。装好测压液于测压计内,调节液面至150 mm。准备供校正用温压计1套,空白组装置2套,对照组装置2套和供试品组装置2套。每个反应瓶中间小杯(内含1小滤纸条)加10%氢氧化钠溶液0.2 mL。除供校正用温压计反应瓶只加Soerensen缓冲液2.5 mL外,其他每个反应瓶中均加入Soerensen缓冲液1.l mL和肝匀浆1.0 mL。空白组瓶中再加入Soerensen缓冲液0.2 mL,对照组瓶中加入参考对照药小牛血清去蛋白注射液0.2 mL[9],供试品组瓶中加入蛙血清小分子肽0.2 mL。
将装好的密闭反应瓶与测压计相连,置37℃恒温水浴中。将测压计右侧柱液面调至150 mm,记下左侧液面初读数(A),反应30 min后将测压计右侧柱液面再调至150 mm,记下左侧液面读数(B)。重复上述操作,进行下一个30 min的反应并记下左侧液面初读数(C)及30min后的液面读数(D)。实验过程中须观察供校正用温压计的压力的变化(ΔC),以消除试验过程中温度及大气压的影响[10]。取2.0 mL肝匀浆,置恒重的装有海沙的称量瓶中,110℃干燥至恒重,计算两次的重量差ΔW(mg)。
1.5.3 计算 呼吸活性计算公式[11]:QO2[μLO2/(mg·h)]=[(A-B+C-D)×K1-ΔC×K2]/G×I。公式中:QO2为氧系数;A、B、C、D为测压计的读数;K1为空白或样品的反应瓶常数;K2为温压计的反应瓶常数;ΔC为校正温压计的体积变化;G为每l毫升肝匀浆的干重,G=ΔW/2-9.3,9.3为Soerensen缓冲液的干重,单位mg;I为反应时间,单位h。
K1、K2计算公式为:{[(VR+VM)×1000-2500]×273/(273+37)+2500×0.0239}/10000。公式中:VR为反应瓶体积;VM为测压计体积;2500为瓶内液体体积(μL);0.0239为37℃时氧的溶解度。
SI=供试品QO2/空白QO2
试验结果必须满足以下条件[12]:对照品组的QO2≥4.0 μLO2/(mg·h)并且SI≥2.5;空白组的QO2≥1.0 μLO2/(mg·h)。
2 结果
2.1 蛙血清超滤组分的RP-HPLC图谱
蛙血清超滤组分经RP-HPLC分离纯化,结果见图1。215 nm波长下,有7个洗脱峰。收集所有的洗脱峰。
2.2 蛙血清超滤组分洗脱峰的质谱图谱
将收集的RP-HPLC洗脱峰成分进行质谱检测,发现峰位22 min的洗脱峰为高纯度肽。22 min洗脱峰中相对分子质量为1638的肽的一级质谱图谱见图2,其相对应的二级质谱图谱见图3。
2.3 蛙血清小分子肽的数据库搜索鉴定结果
将相对分子质量为1638的小分子肽的二级质谱数据经处理后在数据库搜索,没有搜索到相关肽的信息,可能是新发现的肽。
2.4 蛙血清小分子肽的呼吸活性测定结果
检测的空白组、对照组及5组

蛙血清小分子肽样品结果见表1,通过公式计算,得空白组的耗氧量为2.1[QO21.0 LO2/(mgh)],对照组的耗氧量为6.4[QO24.0 LO2/(mgh)],SI 3.0(2.5),均满足试验成功的条件。结果(表2)显示:蛙血清小分子肽的刺
蛙血清小分子肽样品结果见表1,通过公式计算,得空白组的耗氧量为2.1[QO2≥1.0 μLO2/(mg·h)],对照组的耗氧量为6.4[QO2≥4.0 μLO2/(mg·h)],SI 3.0(≥2.5),均满足试验成功的条件。结果(表2)显示:蛙血清小分子肽的刺激指数大于小牛血清去蛋白注射液,表明蛙血清小分子肽比小牛血清去蛋白注射液的药效要更好。
3 讨论
血清小分子肽是指血清中所有相对分子质量低于10 000的小分子蛋白质片段和多肽集合,具有低抗原等特性使其容易被吸收,并参与到细胞的新陈代谢中去,促进体内的新陈代谢[13]。但相对分子质量5000以下的血清小分子肽研究较少[14],因为血清中大分子蛋白含量高,而且还与一些小肽结合在一起,使得分离纯化较难,而相对分子质量在1000~3000的肽含量虽少,但不与大分子蛋白结合,分离提纯比较容易[15]。


 
 
 
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