|
华山松疱锈病的重寄生真菌(深绿木霉)中几丁质酶基因cDNA片段的克隆
|
|
【农业经济类论文】华山松疱锈病是五针松疱锈病的一种,是危害华山松林最为严重的一类病害[1]。目前,对该病的防治主要有物理防治、化学防治、生物防治、营林措施以及抗病育种。其中,化学防治在诸多措施中一直占主导地位,但是仍未能真正有效地控制华山松疱锈病的发生和发展;生物防治和抗病育种已发展成为防治该病的研究热点并被认为是实行可持续防治措施的最有效的手段[2]。Elad等认为木霉菌的重寄生作用是其拮抗病原真菌的主要机制[3]。多数学者认为拮抗木霉菌在寄生过程中产生了一系列降解病原菌细胞壁的水解酶,而与拮抗木霉菌的生防作用有关的胞外酶主要是几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶[4]。陈玉惠等通过重寄生菌的筛选工作,发现木霉SS003对华山松疱锈病的锈孢子具有很强的破坏作用,并证明了这种破坏作用是由锈孢子壁诱导后所产生的酶所致[5]。从分子水平对木霉SS003进行分类鉴定发现其和深绿木霉(Trichoderma atroviride)的ITS序列具有100%的同源性,而且与形态鉴定结果完全一致[6]。笔者对木霉SS003几丁质酶基因的克隆进行研究,以期为阐明重寄生菌的作用机制提供分子方面的证据,也为获得高抗病的转基因植株奠定基础。
1 材料与方法
1.1 木霉菌株 供试菌株木霉SS003由四川广元天台山林场的保湿华山松感病树干病部分离所得。
1.2 木霉SS003中几丁质酶的诱导及活性测定 取一定量的锈孢子反复冻融后加适量蒸馏水研磨成匀浆,5 000 r/min离心20 min,收集沉淀物用蒸馏水冲洗再离心,直至上清液澄清为止,得到的锈孢子壁作为诱导物备用。
参照邱立友[7]的方法,选Czapex培养液为基本培养基并用锈孢子壁取代其中的碳源。将配制好的培养液分装于三角瓶中,每瓶50ml,灭菌后备用。向每瓶培养液中接入4块直径为7mm的木霉SS003菌块,25℃下120 r/min连续振荡培养4 d,过滤得到粗酶液。吸取粗酶液0.5ml,置于40℃水浴锅中预热2min,然后加入经过40℃预热的0.1mg/ml昆布多糖溶液1 ml,混匀
|
|
|
广告服务