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醛脱氢酶8A1融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定
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【免费西医学论文】作者：刘佳莹, 李淑珍, 李晓玲, 刘莹, 柳晓兰, 高建恩, 仲飞, 孙启鸿【摘要】 目的: 重组表达醛脱氢酶8A1（aldehyde dehydrogenase 8 family member A1, ALDH8A1）蛋白, 制备其多克隆抗体, 并进行抗体的特异性鉴定, 以及蛋白在组织和细胞内的定位。方法: 以成人肝cDNA文库为模板, PCR扩增ALDH8A1目的片段, 并构建重组表达载体pGEX4T1ALDH8A1和pET32aALDH8A1, 经测序鉴定插入载体的DNA片段序列正确后, 转化大肠杆菌BL21, 诱导表达GSTALDH8A1和 HisALDH8A1融合蛋白。经Western blot确定其为目的蛋白后, 纯化重组融合蛋白, 并以GSTALDH8A1免疫家兔制备抗人ALDH8A1多克隆抗体。用HisALDH8A1包板, ELISA法测定兔抗人ALDH8A1血清效价; Western blot鉴定兔抗人ALDH8A1血清在重组蛋白和天然蛋白中的反应特异性; 免疫组化法确定ALDH8A1蛋白在组织和细胞中的定位。结果: 成功构建重组表达载体pGEX4T1ALDH8A1和pET32aALDH8A1; 获得包涵体形式表达的GSTALDH8A1和可溶性形式表达的 HisALDH8A1融合蛋白; 应用纯化的重组蛋白GSTALDH8A1免疫家兔, 获得兔抗人ALDH8A1血清, ELISA测定抗血清的效价为1∶256 000。Western blot结果显示, 制备的ALDH8A1兔多抗可特异地识别成人肝总蛋白以及293T、 A549、 HeLa、 U937、 HepG2细胞总蛋白中一个相对分子质量（Mr）约53 000的ALDH8A1天然蛋白, 与文献报道的ALDH8A1的Mr一致, 表明ALDH8A1在正常肝组织与癌细胞中都有表达。免疫组化结果表明ALDH8A1蛋白定位于人肝癌细胞胞质中。结论: 成功制备出兔抗人ALDH8A1多克隆抗体, 此抗体可应用于ELISA, Western blot
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