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中空纤维分离高效液相色谱法测定静脉注射用人免疫球蛋白中的麦芽糖
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【西药论文】作者:孙婷 孙玉刚 李珺沬 蒋晔【摘要】 建立了中空纤维分离HPLC测定静脉注射用人免疫球蛋白中的麦芽糖含量的方法。在离心力的作用下,样品溶液中的小分子物质能透过垂直放置在离心管中的中空纤维,同时离心力也减小了膜外大分子形成的浓差极化。采用InertsilNH2色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)及示差折光检测器,流动相为V(乙腈)∶V(水)=70∶30,柱温40 ℃,流速为1.0 mL/min。麦芽糖浓度在1.00~5.00 g/L范围内线性关系良好(r=0.9999),平均加标回收率为100.6%,RSD为1.4%。本方法简便快速、结果准确,克服了蛋白沉淀不完全,吸附严重等现象,为微量样品的分析提供了简单廉价超滤手段,适用于蛋白类制品小分子样品的前处理。 【关键词】 中空纤维,麦芽糖,静脉注射用人免疫球蛋白,高效液相色谱 1 引 言 静脉注射用人免疫球蛋白在临床上主要用于免疫调节[1],麦芽糖是静脉注射用人免疫球蛋白中的稳定剂。当麦芽糖含量过低时,影响蛋白质的稳定性;含量过高时,则会影响病毒灭活效果。因此,准确控制静脉注射用人免疫球蛋白中麦芽糖的含量十分重要。传统的测定麦芽糖的方法是将样品中的蛋白沉淀后,采用高效液相色谱法测定[2~5]。由于蛋白沉淀时并不完全[6,7],使色谱柱性能逐步发生改变,影响色谱柱寿命。分析测定蛋白中小分子时,需要对蛋白进行沉淀。常用的沉淀蛋白的方法有:甲醇、乙醇、乙腈等有机溶剂沉淀蛋白[8,9],磺基水杨酸等沉淀剂沉淀蛋白[10]和三氯醋酸等强酸沉淀蛋白[11]。未沉淀完全的蛋白直接影响测定结果的准确度, 并且易吸附在色谱柱的填料小孔处,缩短色谱柱的使用寿命。 通常的超滤技术是一种加压膜分离技术,采用切向流过滤方式,使被处理溶液平行于滤膜表面流动,与滤过方向垂直,溶液在压力的作用下滤过,从而减小浓差极化现象,适用于大规模蛋白的分离和纯化[12],但不适合分析级样品的处理。对分析级的样品处理虽然有小型的商品化的离心超滤装置,超滤膜水平放置,在离心超滤过程中,容易产生浓差极化现象,间接导致膜渗流量下降和分离效率降低,仅适用于细胞和大分子的浓缩和制备。近年来,又出现了垂直放置的超滤膜,离心力不仅提供了过滤动力,且几乎与膜平行的离心力减少了浓差极化的形成,但是其平面膜的结构,使得它对离心力有一定的限制。离心力过大,会使膜的孔径发生变化,甚至破裂。本实验采用的U型中空纤维膜与离心力完全平行,可消除浓差极化现象,且由于中空纤维的管状结构,是由管外至管内的过滤方式,因此离心力不影响膜的孔径和超滤性能。实验采用长约15 cm的中空纤维,在相对离心力为1250 g时,就可得到近50 μL的滤液,足以满足色谱分析需求。且简便快速,结果准确,克服了浓差极化现象,容易收集,在蛋白制品前处理中是一种节能环保的分离方法,适合于蛋白类样品的前处理。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 LC20AD泵及RID10A示差折光检测器 (日本岛津公司);TDL5台式离心机 (Anke 公司);聚丙烯中空纤维,壁厚20 μm,外径 400 μm,截留分子量6000(杭州凯洁膜分离技术有限公司)。麦芽糖对照品(100287200601);静脉注射用人免疫球蛋白,蛋白含量5%,批号:200709S01,200709S02,200709S04(河北大安制药有限公司);乙腈(色谱纯, 美国Dikma公司);水为二次蒸馏水。 2.2 色谱条件 Inertsil NH2 色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美国Dikma公司),流动相为V(乙腈)∶V(水)=70∶30,柱温40 ℃,流速为1.0 mL/min,进样量为20 μL。 2.3 实验装置 将中空纤维切成长约15 cm的小段,放入二次蒸馏水中超声清洗15 s,晾干、备用。将两个注射用针头穿过橡胶塞插入已处理好的中空纤维中,并将其置入离心管中。实验装置如图1所示。 图1 中空纤维离心超滤装置 Fig.1 Hollow fiber centrifugal ultrafiltration device 2.4 对照品溶液的制备 准确称取250 mg麦芽糖对照品于25 mL容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液。其中麦芽糖的浓度为10.0 g/L。准确移取1.5 mL对照品储备液于5 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液,其中麦芽糖的浓度为3.00 g/L。 2.5 供试品溶液的制备 准确移取1.5 mL静脉注射用人免疫球蛋白于50 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,作为样品溶液。取样品溶液适量,置“2.3”节下实验装置中,于离心机中离心15 min,相对离心力1250 g,取出中空纤维,用进样器抽出中空纤维内的供试品溶液,每个中空纤维大约可收集50 μL,取20 μL注入色谱柱分析。 分 析 化 学第37卷第9期孙 婷等:中空纤维分离高效液相色谱法测定静脉注射用人免疫球蛋白中的麦芽糖 3 结果与讨论 3.1 系统适应性及专属性实验 在“2.2”节的色谱条件下,分别取麦芽糖对照品溶液和供试品溶液各20 μL进样,记录色谱图(如图2)。麦芽糖出峰时间为8.2 min,理论塔板数以麦芽糖计算不低于5000。实验结果表明,静脉注射用人免疫球蛋白色谱系统的适应性及专属性良好。 3.2 线性关系与检出限 分别量取对照品储备液0.5,1.0,1.5,2.0和2.5 mL于5 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,得一系列标准溶液,各取20 μL进样。以麦芽糖峰面积A为纵坐标,浓度C(g/L)为横坐标,得回归方程:A=1.29×105C+6.59×102(r=0.9999)。结果表明,麦芽糖在1.00~5.00 g/L浓度范围内线性关系良好。取线性对照溶液最低点继续稀释,进样并记录色谱图,按S/N=3计,麦芽糖的检出限为0.25 g/L。 3.3 精密度、重复性及稳定性实验 取同一方法配制成的供试品溶液,连续进样6次,进样量20 μL,记录色谱峰面积,麦芽糖含量的RSD为0.5%。取同一批号(批号:200709S04) 静脉注射用人免疫球蛋白6份,按“2.5”节方法配制成供试品溶液,进样量20 μL,记录色谱峰面积,麦芽糖含量的RSD为0.8%。取同一批号 (批号:200709S04) 静脉注射用人免疫球蛋白,按“2.5”节方法配制成供试品溶液,分别于0,2,4,8和12 h进样分析,记录色谱峰面积,麦芽糖含量的RSD为0.8%,结果表明供试品溶液在12 h内稳定。 3.4 加样回收率实验 取同一批号(批号:200709S04)静脉注射用人免疫球蛋白1.5 mL于50 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,作为样品溶液。准确移取9份样品溶液各5 mL分别于10 mL离心管中;准确移取麦芽糖储备液1.2,1.5和1.8 mL各3份,分别于5 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,分别加入到样品溶液中,按“2.5”节的方法配制供试品溶液,取样品溶液适量,置“2.3”节实验装置中,进样量20 μL,计算麦芽糖平均加样回收率。计算结果见表1。 3.5 样品含量测定 取不同批号的3批静脉注射用人免疫球蛋白,将其用二次蒸馏水稀释100倍,参考“2.5”节的方法配制供试品溶液,加入中空纤维离心超滤装置,进样量20 μL,根据色谱峰面积计算麦芽糖的含量(见表2),结果令人满意。表1 麦芽糖加样回收率测定结果 【参考文献】 1 Ren YueMing (任跃明), Cheng YaQin (程雅琴), Ni DaoMing(倪道明). Chin. J. Biologicals(中国生物制品学杂志), 2005, 18(1): 73~75 2 Lü YingNian (吕应年), Jiang GuiXiang (蒋桂香), Wu KeFeng (吴科锋), Zhu GuangZu (朱光祖). Chin. Hosp. Pharm. J.(中国医院药学杂志), 2006, 26(6): 685~686 3 Gao XueJun (高雪军), Feng DeJie (冯德杰), Li Shu (李 澍), Zhu LiPing (朱莉萍), Cheng Yi (程 夷). Prog. Microbiol. Immunol.(微生物学免疫学进展), 2001, 29(4): 48~51 4 Cai XinXin (蔡欣欣), Zhang XiuYao (张秀尧). Chinese J. Health Laboratory Technology(中国卫生检验杂志), 2007, 17(6): 968~969 5 Cai YQ, L J S, Shi Y L, Liang L N, Mou S F. J. Chromatogr. A, 2005, 1085: 98~103 6 Yin J F, Yang G L, Wang S M, Chen Y. Talanta, 2006, 70: 208~212 7 ChávezServín Jorge L, Castellote Ana I, Carmen LópezSabater M. J. Chromatogr. A, 2004, 1043: 211~215 8 Wei ShouLian (韦寿莲), Zhang SuBin (张素斌), Yan ZiJun (严子军). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2008, 36(4): 499~503 9 Zheng YongYi (郑雍怡), Wang Yan (王 彦), Zhang Ji (张 计), Wang RenFeng (王刃锋), Yan Chao (阎 超). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2008, 36(5): 588~592 10 Zhang YaoTing (张耀廷), Guo Yan (郭 岩), Xin JiHua (辛暨华), Zhou LiWei (周莉微), Zeng Wei (曾 卫), Zheng XiaoLi (郑晓丽). Chin. J. Biologicals(中国生物制品学杂志), 2001, 14(4): 247~248 11 Deng Jian (邓 健), Yuan YaLi (袁亚莉), Xu JinSheng (许金生), Kuang YanHua (匡艳华), Yang ZuoSheng (杨祚升). China Public Health(中国公共卫生), 2000, 16(11): 1041~1042 12 Zhang XiaoNan (张晓楠), Guo LiAn (郭立安). Chinese J. BiochemicaI Pharmaeeutic(中国生化药物杂志), 1999, 20(2): 97~98
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