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PCR技术检测棘阿米巴26S核糖体DNA
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【妇产科西医学论文】【摘要】 目的:用聚合酶链反应(PCR)方法检测棘阿米巴的26S核糖体DNA(26S rDNA,Rns),为早期诊断棘阿米巴角膜炎提供方法。方法:分离培养三株不同基因型棘阿米巴虫株,提取虫株基因组DNA,合成棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a),通过聚合酶链反应(PCR)扩增部分26S rDNA序列。结果:三株不同基因型棘阿米巴虫株属于两种基因型,其中Acanthamoeba sp. CJY/s2株和Acanthamoeba sp.CJY/s株属于Rns T4基因型,Acastellanii Neff株属于Neff基因型。PCR扩增后,Acanthamoeba sp.CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因片段扩增出分子量大小为126 bp 的特定扩增带,而Acanthamoeba sp. CJY/s株的26S核糖体DNA基因片段则未得到预期的扩增带。结论:用棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a)可以有效扩增Acanthamoeba sp. CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因,可以为部分棘阿米巴性角膜炎的早期检测提供新的检测手段。 【关键词】 PCR 棘阿米巴角膜炎 26S核糖体DNA Abstract: Objective: To provide a method for early diagnosis of acanthamoeba keratitis using the polymerase chain reaction (PCR) amplificat the gene 26s-rDNA fragment for different species of acanthamoeba. Methods: Isolated culture 3 groups of different genotype acanthamoeba, which whole genome were extracted, PCR amplificated parts of gene sequence of 26s-rDNA by using acanthamoeba specificity primer (ArDNA-a). Results: In 3 different species acanthamoebas, Acanthamoeba sp. CJY/s2 and Acanthamoeba sp. CJY/s were Rns genotype T4, Acastellanii Neff was Neff. After PCR, 26s-rDNA fragment about 126 base pairs was successfully amplified by single PCR from the genotype DNA of Acanthamoeba sp.CJY/s2 and Acastellanii Neff, but no anticipate fragment was obtained from the genotype DNA of Acanthamoeba sp. CJY/s. Conclusion: When utility the acanthamoeba specificity primer (ArDNA-a),PCR can amplified gene fragment of 26s-rDNA in Acanthamoeba sp. CJY/s2 and Acastellanii Neff, which can prove a new detect method to early diagnosis of some acanthamoeba keratitis. Key words: PCR; acanthamoeba keratitis; ribosomal 26S 棘阿米巴角膜炎(acanthamoeba keratitis,AK)是致盲率极高的慢性进行性角膜炎,由于病原棘阿米巴具有特殊生活史以及感染后病人缺乏特异的临床表现,往往出现漏诊和误诊。早期临床诊断通常采用眼角膜刮片法,极易引起角膜损伤,待确诊后病人多数只能采用眼球摘除术进行治疗。为了提高早期诊断率,也为了减少用传统角膜刮片法给病人带来的痛苦和损伤,本实验在国内、外学者研究的通过聚合酶链反应(PCR)技术诊断的基础上[1~3],探索运用PCR技术扩增棘阿米巴的26S核糖体DNA基因片段是否可以早期快速、灵敏、安全、有效地诊断不同种株引起的角膜炎。 1 材料和方法 1.1 虫株来源 本实验采用的棘阿米巴虫株Acanthamoeba sp. CJY/s2株、Acastellanii Neff株和Acanthamoeba sp. CJY/s株是由延边医学院提供虫株,测序并鉴定,实验人员根据郑善子等[5]建立的分离及培养棘阿米巴的实验方法,对虫种进行保种和传代。 1.2 虫株的保种与传代 分离后的棘阿米巴虫株保存在PYG培养液中,保存温度为10~20 ℃,保存时间为3个月至2年。根据液体的混浊度判定传代时间,约2 w传代一次,传代时要求无菌操作,取原液1 ml装入含有新鲜配置的PYG培养液10 ml的25 ml培养瓶中即完成传代。棘阿米巴在PYG培养液中生长迅速,周期短,只要培养液充足,3~4 d后大部分包囊即可转变为滋养体。 1.3 DNA提取及蛋白含量测定 将要进行实验的三种虫株分装,在PYG培养液中,26 ℃下,3~4 d后包囊转变为滋养体,收集含约不少于1.0×104个棘阿米巴培养液2 ml。用购于上海生工生物科技有限公司的UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒,提取基因组DNA。将提取的三种不同的DNA在DU800核酸/蛋白分析仪下以1:30稀释后测定蛋白含量。对其1:50分装待用。 1.4 PCR反应 将上述不同种株分装的三管DNA分别在同一棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a)作用下,运用PCR技术对棘阿米巴的26S rDNA基因片段进行扩增。引物序列为5′-GGAGCTCCCACGGGAGGCC-3′和5′-TGGACCGCGTGAGGCTGCGGCT-3′,该引物购于上海生工生物科技有限公司。PCR扩增试剂耐热DNA聚合酶(TaqDNA 聚合酶)、MgCL2(25 mmol/L)、10×PCR缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs,10 mmol/L)等均购自杭州昊天生物技术有限公司。PCR反应体系共30μl,其中含有模板DNA5μl,特异性引物(ArDNA-a)2μl,TaqDNA 聚合酶(1.5 U/μl)0.3μl。PCR循环参数为:94 ℃变性5 min预变性。94 ℃变性40 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环,最后72 ℃延伸5 min。 1.5 PCR扩增产物检测 分别取5μl棘阿米巴的26S rDNA基因扩增产物以1:5体积比的6×电泳上样缓冲液混合,加入到含5μg/μl的溴乙锭的1.5%琼脂凝胶上样孔,低分子量蛋白Marker100 bp 购于MBI公司,直流电100 V电泳15 min,紫外灯下观察结果并拍照。 2 结果 2.1 棘阿米巴虫株基因型 经测序并鉴定后可知三株不同基因型棘阿米巴虫株属于两种基因型,其中Acanthamoeba sp. CJY/s2株和Acanthamoeba sp. CJY/s株属于Rns T4基因型,Acastellanii Neff株属于Neff基因型。 2.2 棘阿米巴培养传代结果 2.2.1 倒置显微镜下观察到的棘阿米巴滋养体和包囊见图1。 2.2.2 倒置显微镜下观察到的棘阿米巴3 d后由包囊转变为滋养体(见图2)。 2.3 DNA核酸含量测定结果 利用分光光度计测得Acanthamoeba sp. CJY/s2株DNA核酸含量约为34 ng/μl,Acastellanii Neff株DNA核酸含量约为30ng/μl,Acanthamoeba sp. CJY/s 株DNA核酸含量为约17ng/μl。 2.4 三种不同种株PCR扩增产物电泳结果见图3。 3 讨论 棘阿米巴引起的棘阿米巴角膜炎(acanthamoeba keratitis,AK)是致盲率极高的慢性进行性角膜炎。近年来,随着以隐形眼镜及软性角膜接触镜矫正屈光不正的方法在我国的普遍使用,棘阿米巴角膜炎发病日益增多,我国自1992至2002年已报道的棘阿米巴眼部感染约有150多例,其中约30%~40%左右与角膜接触镜配戴有关[6,7]。目前与人类感染有关的至少有8种。根据18s rDNA(Rns)基因分型结果,感染角膜的虫株多属于Rns T4型,少数属于Rns T3和T6型[8]。本实验中提到的Acanthamoeba sp.CJY/s2株和Acanthamoeba sp.CJY/s株属于Rns T4基因型,Acastellanii Neff株属于Neff基因型。从本实验的病原传代和生活史可见,棘阿米巴的繁殖速度快,由感染的包囊转变为致病的阿米巴所需时间仅三天。但由于包囊在恶劣的条件下长期存活,且该病在早期由于发病者初时多是以单眼畏光、流泪和疼痛为主诉,常缺乏特异性,故该病的角膜炎患者多数都在感染较长时间发病后确诊,且只能进行眼球手术摘除根除治疗。此外另一个重要原因是由于棘阿米巴角膜炎的诊断方法欠敏感及特异性低,重视程度不够,故能够被确诊极少,且分型多,常导致误诊、漏诊、误治。 随着分子生物学技术的不断发展,早期诊断技术由PCR技术渐渐取代了过去常用的角膜刮片寻找病原的技术。国内曾有人用PCR体外扩增棘阿米巴的18s rDNA基因片段进行早期检测[9],但由于棘阿米巴分型过于繁多,因此并不能检出所有的种属。故本实验组成员经反复实验,得出用PCR体外扩增棘阿米巴的26s rDNA基因片段对Acanthamoeba sp. CJY/s2和A.castellanii Neff株在特异性引物(ArDNA-a)作用下均扩增出分子量大小为126 bp的特定扩增带,而Acanthamoeba sp. CJY/s株的26S核糖体DNA基因片段没有得到预期的扩增带。因此运用棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a)可以有效扩增Acanthamoeba sp. CJY/s2和A.castellanii Neff株的26S核糖体DNA基因,可以为部分棘阿米巴性角膜炎的早期检测提供快速、灵敏、安全、有效的新检测手段。至于用PCR体外扩增棘阿米巴的26s rDNA基因片段方法还能对哪些棘阿米巴株进行有效的早期检测,有待进一步的研究。 【参考文献】 [1] Lehmann DJ , Green SM , Morlet N, et al. Polymerase chain reaction analysis of corneal epithelial and tear samples in the diagnosis of Acanthamoeba keratitis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,1998,39(3) :1261-1265. [2] Mathers WD , Nelson JL , Wilson ME , et al. Confirmation of confocal microscopy diagnosis of Acanthamoeba kerati-tis using polymerase chain reaction analysis[J]. Arch phthalmol, 2000,11(8):178-183. [3]靳雷,井上美智子. 聚合酶链反应技术对棘阿米巴角膜炎诊断的临床应用[J]. 临床眼科杂志,2003,11(2):124-125. [4] 张岩,孙旭光. 棘阿米巴的分型及鉴定研究进展[J]. 国外医学眼科学分册,2002,26(4):214-217. [5] 郑善子,申成华,王铁,等.棘阿米巴分离及实验室培养[J].延边大学医学学报,2003,26(3):168-170. [6] Schaumberg DA, Snow KK, Dana MR. The epidemic of Acanthamoeba keratitis: where do we stand? [J].Cornea,1998,17(1):3-10. [7] Van klink F, Taylor WM, Alizadeh H, et al.The role of macrophages in Acanthamoebs keratitis [J].lnvest Ophthalmal Vis Sci,1996,37(7): 1271-1281. [8] 张岩, 孙旭光, 邓世靖,等.角膜炎棘阿米巴的18s rDNA基因型鉴定[J].中华眼科杂志,2004,40(6):389-394
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