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霍乱弧菌新类型溶源性噬菌体基因组结构研究其它医学
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【中医学本科毕业论文】 作者：芮勇宇，阚飙，高守一，刘延清，祁国明【关键词】 霍乱弧菌；噬菌体；序列 分析 ,摘要：目的 研究 霍乱弧菌埃尔托型（EVC）新类型溶源性噬菌体（CTXφ）和核心区不含ctxAB基因的溶源性噬菌体（nct-CTXφ）基因组的结构。 方法 采用基因扩增、测序及序列生物信息学等方法进行观察与分析。结果 在我国EVC中，存在仅携带古典型（class）nct-CTXφ、CTXφ或埃尔托型（ET）CTXφ基因组类型，并发现nct-CTXclassφ和CTXETφ共存、nct-CTXnewETφ和CTXclassφ共存的新类型。CTXφ和nct-CTXφ基因组zot基因3′末端，60bp序列中40%位点不同，推测的氨基酸序列中60%位点不同。class、ET和newET类型ig1、rstR和ig2基因序列同源性分别为770%～974%，104%～179%，96%～648%，RstR同源性92%～241%。CTXφ基因组均位于染色体TLC基因簇附近。上述不同类型EVC的tcpA、TcpA、ctxA、ctxB、CtxA和CtxB与GenBank中EVC和O139群产毒株的同源性分别>99%，99%，99%，98%，98%和96%。结论 首次在EVC中发现nct-CTXclassφ和CTXETφ、nct-CTXnewETφ和CTXclassφ共存的新类型。
关键词：霍乱弧菌；噬菌体；序列分析
Study on structures of new types of CTXφ and nct-CTXφ genomes
Abstract：Objective To study on structures of new types of CTXφ and nct-CTXφ genomes of EI Tor biotype vibrio cholerae.Methods PCR,sequencing and sequence analysis were conducted.Results Only nct-CTXclassφ,CTXclassφ,or CTXETφ genome type,nct-CTXclassφ and CTXETφ,nct-CTXnewETφ and CTXclassφ genomes coexisted types in EI Tor strains isolated from China were found.Different rates of last 60 bp of zot gene and Zot of CTXφ and nct-CTXφ were 40% and 60%.Identities of ig1,rstR,ig2 gene and RstR of class、ET and newET types were 77.0%～97.4%,10.4%～17.9%,9.6%～64.8%,and 9.2%～24.1% differentially.Different types of CTXφ genome were found near TLC cluster.Identities of tcpA,TcpA,ctxA,ctxB,CtxA,and CtxB of strains in this study with others toxic EVC and O139 VC were over 99%,99%,99%,98%,98%,and 96%.Conclusion nct-CTXclassφ and CTXETφ,nct-CTXnewETφ and CTXclassφ genomes coexisted types in EI Tor were found first.
Key words：vibrio cholerae;phage ;sequence analysis
霍乱弧菌(VC)的溶源性噬菌体（CTXφ）与新类型霍乱病原菌的产生密切相关，CTXφ基因组包括RS区和核心区。RS区依次包括ig1间隔区、rstR、ig2间隔区、rstA、rstB和rstC基因。其中主要变异基因为抑制子基因（rstR）及ig2，国外已报道了3种类型，分别发现于O1群霍乱弧菌古典生物型（CVC）、埃尔托生物型（EVC）和O139群VC，GenBank序列号分别为VCU83796、AF055890、AF110029，本文暂时命名为古典型（class）、埃尔托型（ET）和加尔各答型（calc）〔1- 5〕。核心区依次包括cep、orfU、ace、zot和ctxAB基因，核心区不携带ctxAB基因的CTXφ称为nct-CTXφ。本课题在研究我国EVC的CTXφ和nct-CTXφ基因组分布特征时，发现1种新类型rstR-ig2基因，暂命名为newET类型，还发现不同类型rstR-ig2基因的CTXφ和nct-CTXφ基因组共存的新类型。现将结果报告如下。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株 霍乱弧菌EVC（ 中国 疾病预防控制中心），其中携带rstR-ig2基因的类型及菌株数分别为class 10株，ET 10株，class 和ET共存10株，class和newET共存4株。对共存类型利用ctxAB和zot基因探针Southern杂交，zot基因的拷贝数均多于ctxAB，表明这些菌株同时携带不同rstR-ig2类型的CTXφ和nct-CTXφ基因组。
112 主要试剂和仪器 Taq DNA 聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶（中国华美生物工程公司）；Gene Amp PCR system 9600型PCR扩增仪（美国PE公司）；GDS7500型凝胶成像仪(英国UVP公司)。
12 方法
121 引物设计 利用Oligo60软件进行引物设计，引物在上海生工公司合成。扩增片断分别为：（1）上游引物CTRS上5′-ATT GAC AGG ATG AAG GAT ACC-3′，下游引物rstA下5′-CGG AAT TCT CGA CAT CAA ATG GCA TG -3′，用于扩增CTXφ基因组串联体的第1个基因组末端和第2个起始端之间的基因，扩增片断简称为CR，约1500bp，片段包括ctxB 3′端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5′端部分基因。（2）上游引物ZCT上5′- GCT ACA AGG TGC TAC CGT TAC -3′，和引物rstA下配对，用于扩增nct-CTXφ基因组串联体的第一个基因组末端和第2个起始端之间的基因，扩增片断简称为ZR，约1500bp，包括zot 3′端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5′端部分基因。对CR和ZR扩增产物进行酶切鉴定，内切酶选用RsaI和BglII。（3）上游引物TLC上5′-CTT GGA TTA AGT CAA CCA GAG -3′，和引物rstA下配对，扩增片断简称为TR，约20kb，包括TLC基因簇3′端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5′端部分基因。对扩增产物进行酶切鉴定，内切酶选用RsaI和BglII。（4）ctxAB基因分段扩增：利用ZCT上和ZCT下5′- GTG TGT TGT GGT ATT CTG CAC -3′，引物CTB上5′- GGT GTA AAA TTC CTT GAC G -3′和CTB下5′- GCT TCT CAT CAT CGA ACC -3′扩增，扩增片段分别约1000和550bp。（5）tcpA基因扩增：引物tcpA上为5′- AGA ACA CGA TAA GAA AAC CG -3′和tcpA下5′- AAC GCT GGA TTT GAG ATG AC -3′，扩增片段约900bp。
122 PCR扩增及酶切 PCR反应体积50μl，1×PCR缓冲液，100μmol dNTP，05μmol引物，10 U Taq DNA聚合酶，模板约100ng（采用SDS裂解-酚氯仿抽提-乙醇沉淀方法制备）。PCR扩增的循环参数为：94℃ 5min；94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s～2min，30个循环；72℃ 5min。扩增产物在10%的琼脂糖凝胶上（含05μg/ml 溴乙锭）电泳，长波紫外线下观察并将PCR产物条带割下，利用试剂盒回收凝胶中PCR产物，回收的PCR产物直接作为测序模板。直接对PCR产物进行酶切，按内切酶试剂盒说明书操作，酶切产物同上电泳，紫外灯下观察并拍照。
123 PCR产物测序及序列分析 提供PCR扩增产物和扩增用引物作为测序引物，由上海博亚公司测序，对PCR产物直接测序。序列拼接及生物信息学分析 应用 DNAStar软件分析，网上同源比较应用http://wwwncbinlmnihgov网站BLASTn序列分析软件。
2 结果
21 CR和ZR基因扩增产物酶切及测序结果（图1，图2） 图1可见，扩增双拷贝nct-CTXφ基因组的ZR产物经酶切分析共分为2种类型，经测序表明rstR-ig2分别为class和newET类型，测序菌株分别为86015株和JX94484株。扩增双拷贝CTXφ基因组的CR产物经酶切分析共分为2种类型，经测序表明rstR-ig2分别为ET和class类型，测序菌株分别为S2株和S73株。
1：DL2000 DNA Marker；2：ZR86015；3：JX94484；4：CRS2；5：CRS73
图1 ZR和CR的PCR产物RsaI酶切图谱（略）
1：DL2000 DNA Marker；2：ZR86015；3：JX94484；4：CRS2；5：CRS73
图2 ZR和CR的PCR产物BglII酶切图谱（略）
图2可见，ZR和CR扩增产物测序结果表明：CTXφ和nct-CTXφ基因组zot基因3′末端60bp序列中40%位点不同，推测的氨基酸序列中60%位点不同；nct-CTXφ基因组在zot基因终止密码子后12bp处为ER序列，其后为ig1序列，无CTXφ基因组zot和ctxA基因之间的序列；class、ET和newET类型ig1、rstR和ig2基因序列同源性分别为770%～974%，104%～179%，96%～648%，rstR推测的氨基酸序列同源性为92%～241%。
22 TR基因扩增、酶切及测序(图3) 携带CTXφ和/或nct-CTXφ基因组的EVC，TR基因扩增均阳性，经RsaI和BgⅢ酶切共分为2个类型。测序表明，rstR-ig2基因分别为ET和class类型，测序菌株分别为SC8511和SC9773。
1：DL2000 DNA Marker；2，4和6模板为SC8511，分别为TR基因PCR产物及BgⅢ和RsaI酶切产物；3，5和7模板为SC9773，分别为TR基因PCR产物及BgⅢ和RsaI酶切产物
图3 TR基因PCR扩增及酶切图谱（略）
23 ctxAB基因测序结果 对SC9773株、SC8511、SC94118株和SC98107株的ctxAB基因分段扩增及测序，测序结果与标准菌株N16961的ctxA和ctxB基因的同源性分别>99%和98%，推测的氨基酸序列的同源性分别>98%和96%。
24 tcpA基因测序结果 对SD86015、SC9773株、SC8511、SC94118株和SC98107株的tcpA基因测序，tcpA基因及推测的TcpA氨基酸序列，与GenBank中查询到的EVC和O139群产毒株的同源性均>99%。
25 GenBank收录基因序列号 本 研究 被GenBank收录的基因序列号分别为:AF511006，AF511007，AF511008，AF521415，AF12401，AF510996，AF510994，AF510995，AF516343，AF511000，AF510999，AF511003。
3 讨论
将上述研究结果与本课题组已完成的分子流行病学资料〔6〕结合 分析 。结果表明， 不同rstR-ig2类型（以上标形式表示）的CTXφ和/或nct-CTXφ基因组及代表菌株分别为：携带nct-CTXclassφ基因组的SD86015株、携带CTXclassφ基因组的SC9773株、携带CTXETφ基因组的SC8511、同时携带nct-CTXclassφ和CTXETφ基因组的SC94118株、同时携带nct-CTXnewETφ和CTXclassφ基因组的SC98107株，后2种共存类型为国内外首次发现〔7,8〕。tcpA基因编码的TcpA组装的TCP菌毛是CTXφ感染霍乱弧菌的受体，本研究发现共存类型的tcpA基因序列同EVC标准菌株N16961株均100%同源，提示nct-CTXclassφ、CTXETφ、nct-CTXnewETφ和CTXclassφ均可能以该类型TCP菌毛为受体而感染霍乱弧菌〔9〕。对CTXφ和/或nct-CTXφ基因组在染色体插入位点附近序列分析显示，CTXETφ和CTXclassφ基因组均与TLC基因簇相邻，除SD86015株nct-CTXclassφ基因组与TLC基因簇相邻，其他菌株的nct-CTXclassφ和nct-CTXnewETφ附近染色体序列均不是TLC基因簇，是何种基因有待进一步研究〔5〕。RS区的ig 2间隔区包括rstR基因的启动子和rstA的操纵区，RstR与rstA的操纵区结合并抑制rstA基因表达，RstR是rstA型特异性抑制子，也决定了噬菌体免疫性，即携带某一类型rstR基因的VC不再感染同类型的CTXφ或nct-CTXφ。class、ET和newET类型rstR-ig2基因及RstR序列同源性均非常低，这也是不同rstR-ig2类型nct-CTXφ和CTXφ基因组共存于同一菌株的 理论 基础。霍乱弧菌只要携带CTXφ基因组即可产生霍乱毒素，导致霍乱样腹泻，为什么部分菌株同时携带不同rstR-ig2类型的nct-CTXφ基因组，共存的意义也有待进一步研究〔3〕。
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